质粒DNA的提取及浓度检测.ppt

分子生物学实验任课教师 张淑平 62773628 李英姿 62781668 助教博士生 李颖华 62773628 黄波 62783845 唐颖 62772214 课程基本情况简介 质粒DNA提取 基本技术 核酸的分离纯化 IsolationandPurificationofDNAandRNA 电泳技术 GelElectrophoresis 基因重组 亚克隆及表达 GeneRecombination SubcloningandExpression PCR技术 PolymeraseChainReaction 分子杂交及互作 MolecularHybridizationandInteraction DNA测序技术 DNASequencing 基因功能的研究技术 GeneFunction 基因的染色体定位 LocalizationofGenetoChromosomes 生物芯片技术 Bio ChipsorBioarray 以完整 常用 重要为原则 经典与先进技术相结合 同时介绍相关知识 尽量让学生在有限的学时内掌握更多的分子生物学技术以及相关的知识 我们的分子生物学实验课程的设计从整体上可以说是一个完整的大实验 因为自始至终 各实验之间相互连贯 要求学生每一次实验既得到本次实验的结果 同时也为下一次更深入的实验做准备 提供实验材料 课程基本情况 实验安排与实验报告 注 实验报告分为1 2 3 4 实验6的设计 4 5 6 7 8 9 10 6 重组克隆的鉴定实验的几点说明 手工提取质粒方法将在 实验一 中讲到 实验六 上课时间将提前到下午1 00 接种培养将在 重组克隆的鉴定 实验课的前一天的晚上进行 7 30 9 00pm 9 00 10 20 助博将准备好试管LB培养基 用前别忘了加你需要的抗生素 提供的酶包括EcoRI XhoI BamHI HindIII XbaI 自己选择正确的酶使用 实验方案由学生自己设计 要提前进行 目的意义 材料和方法 结果及讨论 以下几点请注意 实验操作基本要求 认真预习实验指导 按照操作规程使用仪器设备 注意个人以及公共设施安全 节约实验试剂及材料 实验完毕后 将实验器皿清洗干净 并清理实验台面 按时 按质 按量完成实验工作 不迟到 不早退 实事求是 认真而及时地写出实验报告 评分考虑 平时实验课成绩70 综合技术测验30 实验一质粒DNA的提取及浓度检测 目的与要求通过质粒的一些特性 质粒DNA的提取 测定 学习用碱变性法提取质粒DNA的方法 了解用分光光度计测定DNA含量的方法 2 相关知识及原理 质粒 Plasmid 独立于染色体外的 能自主复制且稳定遗传的遗传因子 是一种环状的双链DNA分子 存在于细菌 放线菌 真菌以及一些动植物细胞中 在细菌细胞中最多 DNA超螺旋结构 细菌质粒 细菌质粒是用的最多的质粒类群 其大小从1Kb 200Kb 它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系 严谨型 这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的 与寄主细胞的复制偶联同步 所以 往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝 松驰型 这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的 每个细胞中含有10 200份拷贝 如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份 如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒 要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数 质粒类型 载体 Vector 用于携带重组DNA 并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒 运载工具 具备的条件 易于鉴定 在受体细胞中可以独立复制 易于筛选 易于导入受体细胞 抗性基因 Antibioticresistancegene suchasAmpicillinresistancegene Kanamycineresistancegene 启始复制子 ori Originofreplication 多克隆位点 MSC Multiplecloningsiteorpolylinker 标记基因 Markergene suchasLacZgene 载体的结构 DNA是具有一定结构的物质 一些特殊的环境会导致DNA的变性 如加热 极端pH值 有机溶剂 尿素 酰胺试剂等 而适宜的环境又可以使DNA复性 原理 SDS是一种阴离子表面活性剂 它既能使细菌细胞裂解 又能使一些蛋白质变性 所以SDS处理细菌细胞后 会导致细菌细胞壁的破裂 从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来 释放出来的DNA遇到强碱性 NaOH 环境 就会变性 然后 用酸性乙酸钾来中和溶液 使溶液处于中性 质粒DNA将迅速复性 而基因组DNA 由于分子巨大 难以复性 离心后 质粒DNA将在上清中 而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部 通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来 细菌裂解的方法 碱裂解法 0 2molNaOH 1 SDS煮沸裂解法 沸水煮沸40秒SDS裂解法 10 SDS 一般用于质粒大量提取 测定DNA浓度的方法主要有两种 即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值 第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量 另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳 与标准分子量相比较 DNA浓度的测定 紫外光吸收法 因为组成核酸的碱基 G A T C 在260nm处具有强吸收峰 所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量 但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同 因此 一般在中性pH值左右的环境中进行测定 这种方法常用于测定比较纯的样品 3 材料与试剂材料 含有质粒pCMV Myc T10的大肠杆菌DH5 pCMV Myc是一种哺乳细胞表达载体 它含有一个N端c Myc尾 常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵母双杂交结果 Suitablehoststrains DH5a HB101 andothergeneralpurposestrains Selectablemarker plasmidconfersresistancetoampicillin 100mg ml toE colihosts E colireplicationorigin pUCCopynumber 500 pCMV Myc T10 4 步骤质粒DNA的提取碱裂解法 溶液1 GET缓冲液 50mmol L葡萄糖 10mmol LEDTA 25mMTris HClpH8 0 溶液2 0 2mol LNaOH 1 SDS溶液3 乙酸钾溶液 3M pH 4 8 60mL的5mol LKAc 11 5ml冰醋酸 28 5mLH2OTE缓冲液或水 20 g mlRNase 10mmol L Tris HCl 1mmol L EDTA pH8 0 100 乙醇 70 乙醇 注意 用移液器操作时 每一步都要格外小心 特别是在加入溶液II和III后 一定不要剧烈振荡 以免切碎DNA 包括质粒DNA和基因组DNA 培养细菌 将带有质粒的大肠杆菌接种到1 5 3ml含有相应抗生素的液体培养基 37 培养12 16小时 取液体培养液1 5 3ml于Eppendorf管中 10000r min离心1min 去掉上清液 加入100 l溶液1 GET 充分混匀放置3 5分钟 加入200 l新配制的0 2mol LNaOH 1 SDS 变性液 加盖颠倒6 7次使之混匀 冰上放置5min 质粒小量提取的方法 手工提取 加入150 l乙酸钾溶液 溶液II 加盖后颠倒6 7次混匀 冰上放置5min 用台式高速离心机 10000r min离心7min 上清移入另一干净离心管 并加1ml100 乙醇混匀 12000r min离心5min 弃去上清液 沉淀用0 5ml70 乙醇清洗一次 12000r min离心5min 弃去上清液 小管倒置于吸水纸上 除尽乙醇 室温自然干燥 加入30 50 l含有20 g mlRNase的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物 室温放置15 30min 使DNA充分溶解 有时需要酚 氯仿抽提 将分离出的质粒DNA置于 20 保存备用 Biodev 博大泰克 质粒快速提取试剂盒 plasmidrapidisolationkit 碱裂解法 离心柱结构 特殊硅基质吸附材料 使用前按说明再溶液I中加入RNase 向洗脱液中按1 3的比例加入无水乙醇 操作步骤 收集1 5 3ml菌液沉淀于1 5ml离心管中 加入100 l溶液1 振荡至彻底悬浮 为了获得高质量的质粒DNA 培养细菌的时间不宜过长 一般为12小时 细菌沉淀中加入溶液1后 一定要彻底悬浮 否则抽提质粒DNA的纯度及得率会大大降低加入150 l溶液2 立即轻柔颠倒离心管数次 使菌体充分裂解 裂解后的菌体变得清亮 随后将离心管冰上放置1 2分钟 时间勿超 加入150 l溶液3 立即温和颠倒离心管数次 室温放置5分钟 12000rpm离心12分钟 要获得更好得质粒提取效果 请于步骤2和步骤3后 冰上放置 将420 l结合缓冲液加入离心柱中 然后将步骤3的上清加入离心吸附柱中 尽量去除杂质 混匀 12000rpm离心30秒钟 倒掉废液收集管中得溶液 加入750 l洗涤缓冲液于离心吸附柱中 12000rpm离心1分钟 浓缩漂洗液配置成工作浓度时 一定要使用无水乙醇 否则 吸附于硅基质材料上的DNA可能被洗脱下来 影响回收效率 A 重复步骤5一次 B 随后 再次于12000rpm空管离心2分钟 尽量除去漂洗液 洗涕时 即步骤5和6 一定要尽量除去漂洗液 否则 漂洗液中得乙醇会抑制后续得各种酶促反应 必要时 可适当延长离心时间或者用Tip头吸净 如果含有较多得蛋白 盐类等杂质 可多洗涤几次 小心取出离心吸附柱 将其套入一个干净的1 5ml离心管中 加入50 l洗脱缓冲液 室温放置5分钟后 12000rpm离心1分钟 洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质材料得正中 以确保被吸附在硅基质材料中得DNA都能被洗脱下来 为提高回收效率 可适当加大洗脱液体积及洗脱次数 为了充分除尽RNA的污染 可在提取的质粒中加入0 5 lRNaseA 10mg ml 这并不影响其他后续实验 所提取的质粒的纯度足以用来作为测序模板和其他酶促反应 若提取的质粒大于10Kb 在加入洗脱缓冲液后 可在70 水浴中放置3 5分钟 以确保质粒DNA的完全洗脱 B 用分光光度计法定量DNA取2 l提取的质粒DNA 加入98 l蒸馏水对待测DNA样品做1 50 或更高倍数的稀释 蒸馏水作为空白 在波长260nm 280nm处调节紫外分光光度计读数至零 加入DNA稀释液 测定260nm及280nm的吸收值 260nm读数用于计算样品中核酸的浓度 OD260值为1相当于约50 g ml双链DNA 33 g ml单链 可根据在260nm以及在280nm的读数的比值 OD260 OD280 估计核酸的纯度 一般DNA的纯品 其比值为1 8 低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染 记录OD值 通过计算确定DNA浓度或纯度 公式如下 dsDNA 50 OD260 稀释倍数以上浓度单位为 g ml C 凝胶电泳检测DNA的浓度 0 8 的琼脂糖凝胶 100V 40分钟 NEB标准分子量片段 1kbDNALadder 1kbDNALadder虽然不能对DNA质量进行精确定量分析 但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据 每条带大概的量如下 按0 5 g上样量计 应按13条带计算 因为3kb的量是其它片段量的近三倍 0 5kb的条带由500bp和517bp组成 这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一 5 实验报告目的与要求实验原理材料与方法结果与讨论