EGFR突变检测意义及方法学简介-26Aug.ppt

EGFR突变检测意义及方法学简介鹿亚超 PeterLu 阿斯利康中国创新研究中心 ICC 2011年08月26日 Xiamen 内容 为何要检测EGFR突变EGFR突变类型及意义标本因素对突变检测的影响突变检测流程与方法概述ARMS试剂盒检测EGFR突变非肿瘤组织标本检测EGFR突变进展 具有EGFR基因敏感突变者TKI疗效显著 1JCO2006 2 5ASCO2006 6ASCO20077MokTSetal NEJM2009 8MaemondoMetal NEJM20109MitsudomiTetal LancetOncology2010 70 4 EGFR基因突变检测在临床应用的意义 1 2 为何要检测EGFR突变 2 2 IPASS 根据突变状态的疗效分析 0 4 8 12 16 20 24 Timefromrandomisation months 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 ProbabilityofPFS GefitinibEGFRM n 132 GefitinibEGFRM n 91 Carboplatin paclitaxelEGFRM n 129 Carboplatin paclitaxelEGFRM n 85 GefitinibEGFRM n 132 GefitinibEGFRM n 91 Carboplatin paclitaxelEGFRM n 129 Carboplatin paclitaxelEGFRM n 85 EGFR基因突变检测概念 EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态检测并不是 EGFR基因DNA拷贝数的检测 FISH法 EGFR蛋白表达量的检测 IHC法 X NatureReview2007 7 169 NSCLC中EGFR酪氨酸激酶区突变种类 EGFR突变类型与吉非替尼治疗敏感性 Moketal 2008Kimetal 2008Hirschetal 2006AZIn HouseData Unpublished 标本采集及病理评估 DNA抽提及质控 检测报告 EGFR突变检测 ARMS 测序法 其它方法 EGFR突变检测流程 EGFR突变检测中的相关角色 患者 临床医生 胸外科医师 内镜医师 收集肺癌组织标本 病理科医生 准备样本 实验操作及结果分析 实验室人员 报告结果给临床医生 肿瘤科医生放疗科医生呼吸科医生 标本因素对EGFR突变检测的影响 肿瘤组织特点 遗传异质性 对检测方法敏感度有较高要求 用于EGFR突变检测的标本 肿瘤组织 目前最可靠的标本 其它样本 外周血 血浆 血清 细胞学 胸水 痰液细胞学 支气管刮取物 仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用 标本因素对EGFR突变检测的影响 组织标本种类 对检测方法有相应要求 组织标本及DNA质控尤其重要 肿瘤组织标本的采集及病理评估 肿瘤组织标本 病理学评估 组织切片 非小细胞性肺癌诊断及类型肿瘤细胞比例肿瘤细胞总数标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞 H E染色片用于病理评估白片用于提取DNA建议最少切片数 手术标本 5 mX4 小活检标本 5 mX8 组织标本来源手术标本支气管下活检经皮穿刺活检标本处理及贮存新鲜冻存 液氮或 80CFFPE DNA提取及质控 推荐用QIAGEN或类同试剂盒提取DNA紫外分光光度计 适合新鲜组织DNA质控测定总量 OD260 及DNA纯度 OD260 280 qPCR FFPE来源DNA的最可靠质控方法检测可扩增的DNA片断评估是否存在PCR抑制剂 DNA10倍稀释后 ME PCR Sequencing O Transferproduct addreagent opentube PCR Real timeDetection PCR Clean up SequencingRxn CapillarySequencing PCR PCR Clean up SequencingRxn CapillarySequencing PCR Hetero duplex CapillaryElectro phoresis ARMS PNA LNAclamp PCR Sequencing NestedPCR Sequencing PCR HRMA dHPLC PCR RFLP PCR RFLP Electro phoresisSizing PCR PCR Clean up SequencingRxn CapillarySequencing RFLP O O O O O O O O O O O O TaqMan Clean up O Clean up O Clean up O O O O PCR SURVEYORcleavage dHPLCSizing O Confirmationbysequencing PCR SURVEYOR PCR Clean up Pyro sequencingRxn PyroSequencing O O 1 2 3 4 5 6 Steps 7 突变检测的各种方法 流程与敏感度 Confirmationbysequencing O Confirmationbysequencing O O O 1 10 3 10 10 3 12 20 30 20 30 1 PCR Real timeDetection 10 直接测序法流程及数据分析 PCR 纯化 测序反应 测序仪毛细管电泳 纯化 数据分析 EGFRdeletion EGFRL858R 电泳质控 组织标本 DNA PCR是关键 特异性 产物长度 必要时巢式 建议通用测序引物 ARMS法基本原理 等位基因特异性PCR 荧光探针 ARMS方法 DNA ARMS反应 实时定量PCR ARMS法操作流程及数据解读 数据分析 内参信号 HEX 突变信号 内参信号 标本 1 突变阳性 标本 2 突变阴性 突变信号 FAM 组织标本 内参信号 HEX DxSARMS与ADxARMS SFDA认证 应用比较 DxSARMS与ADxARMS 与张绪超 吴一龙教授等合作共同完成 检测结果比较 结论 ADxARMS与DxSARMS具有相近的敏感性和特异性 突变判读 测序法与ARMS法比较 测序法与ARMS法应用实例 FHirsch etal JCO2006CZhu etal JCO2008TMok etal DiscoveryMed2009 非肿瘤组织标本检测EGFR突变进展 用外周血游离DNA cfDNA 检测肿瘤EGFR突变用细胞学标本检测肿瘤EGFR突变 癌性胸水 经支气管细针穿刺样本 用外周血cfDNA检测肿瘤EGFR突变 肿瘤病人外周血cfDNA特点 cfDNA血浆中浓度可以很低 10 1200ng mL cfDNA片段很短 180bp 可能多由凋亡产生肿瘤释放的cfDNA在总cfDNA中的比例可以很低 3 93 核心问题 应该用哪种血标本提取cfDNA 血浆还是血清 哪种方法适合用于cfDNA突变检测 用cfDNA进行突变检测的敏感性与特异性如何 用外周血cfDNA检测肿瘤EGFR突变的文献报告 敏感性 75 特异性 97 注 肿瘤组织为测序法检测 ARMS法检测cfDNA中EGFR突变 Kimuraetal BrJCancer2007 97 6 778 784 数字PCR检测cfDNA中EGFR突变 敏感性 79 特异性 100 注 肿瘤组织为数字PCR及测序法检测 Yungetal ClinCancerRes2009 15 6 2076 2084 PCR dHPLC检测cfDNA中EGFR突变 敏感性 82 特异性 90 Baietal JClinOncol2009 27 2653 2659 用血浆还是血清提取cfDNA unpublisheddata cfDNA得率比较 血清cfDNA 血浆cfDNA EGFR缺失突变 EGFR缺失突变 EGFR缺失突变 EGFR缺失突变 血浆似乎比血清好 突变富集PCR 测序 哪种方法更适合用于cfDNA突变检测 unpublisheddata 直接测序不适合ARMS法 数字PCR dHPCL均有高检出率报道 但须更多数据支持 WANGetal ChineseMedicalJournal2011 124 6 887 891 测序与ARMS 用癌性胸水检测EGFR突变 用肺腺癌胸水中细胞检测EGFR突变 Kimuraetal CancerSci2006 7 7 642 648 EGFR突变检出率 ARMS法35 测序法13 用胸水中细胞及无细胞液同时检测EGFR突变 EGFR突变检测 细胞成份与无细胞液均可 突变富集PCR法比测序法敏感 Zhangetal LungCancer2008 60 175 182 用胸水检测肿瘤EGFR突变需要敏感方法用胸水中细胞及无细胞液均可检测EGFR突变 且检出率基本相同目前缺少胸水与肿瘤组织直接对比 配对样本检测 数据 故对其敏感度与特异性尚无结论 经支气管细针穿刺样本检测肿瘤EGFR突变 EGFR突变检出率 ARMS法29 测序法14 CHEST2007 131 6 1628 1634 用细针穿刺样本检测肿瘤EGFR突变需要敏感方法ARMS法比测序法更适合目前缺少小活检肿瘤组织与外科手术切除肿瘤组织直接对比 配对样本检测 数据 故对其敏感度与特异性尚无结论 小结 如何成功开展EGFR突变检测 了解你的标本 新鲜 冰冻组织 FFPE组织 手术标本 小活检标本选择合适的方法 ARMS是目前较敏感快速方法 且容易开展 测序是传统的方法 但敏感度有限 过程复杂 不易普及做好组织标本及DNA质控是关键非肿瘤组织标本的有效利用 在无肿瘤组织情况下 外周血cfDNA 胸水及细针穿刺等细胞学标本均可用于检测EGFR突变 但其确切的敏感度与特异性尚需进一步探索 必须选择足够敏感的方法 谢谢