目的基因的原核诱导表达及SDS-PAGE凝胶电泳.ppt

目的基因的原核诱导表达及SDS PAGE凝胶电泳 现代分子生物学大实验 实验目的 重点掌握表达载体构建的原理及方法掌握目的基因原核诱导表达的原理及方法了解目的蛋白质 标签 纯化的基本原理和方法掌握PAGE变性凝胶电泳的原理及方法掌握考马斯亮蓝染色的方法 目的蛋白质的诱导表达目的蛋白质的纯化目的蛋白质的检测 实验原理 蛋白质的表达 将克隆基因插入合适载体后导入宿主细胞表达大量蛋白质的方法 体内很难分析单个蛋白质的作用进行大量表达和纯化是为了在体外进行研究应用于蛋白纯化 定位及功能分析等方面 实验原理 图pET14b His TAT EGFP p38 16peptides融合蛋白在Hela细胞中的荧光显微镜检测 400 例 酵母表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有正常的活性 构象技术难度较大 耗时 耗资 大肠杆菌表达系统实验技术简单 时间较短 费用低 系统比较完备不能有效地对重组蛋白质进行修饰加工 易形成包涵体 原核细胞表达系统真核细胞表达系统 实验原理 原核细胞表达系统菌株菌株内源的蛋白酶过多 可能会造成外源表达产物的不稳定 所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株 堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型 也是我们非常熟悉的表达菌株 大名鼎鼎的BL21 DE3 融源菌则是添加T7聚合酶基因 为T7表达系统而设计 实验原理 原核表达质粒的构建目的基因表达载体 实验原理 目的基因 DNA PCR 酶切 Primer例 p38中抑制多肽16肽序列GGAAGAACATTGTTTCCTGGTACAGACCATATTGATCAGTTGAAGCTCF5 ACGGATCCTAGGAAGAACATTGTTTCCTGGT 3 R5 ACGGATCCTTAGAGCTTCAACTGATCAATATGG 3 5 端引物中AC是随机保护碱基 GGATCC是BamHI酶切位点 TA是为防止移码而引入的两个碱基 随后是编码16肽前7个氨基酸的碱基序列 3 端引物中AC是随机保护碱基 GGATCC是BamHI酶切位点 TAA是终止密码子的反向互补序列 随后是从编码16肽碱基序列的最后一个碱基开始的反向互补序列 实验原理 表达载体能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中 在基本骨架的基础上增加表达元件 就构成了表达载体 元件启动子 终止子 核糖体识别序列诱导性表达所需要的元件操纵子序列调控基因多克隆位点融合Tag复制起始序列筛选标记 报告基因各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异 实验原理 启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一 从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达 lac和Tac PL和PR T7是最常用的启动子 转录终止子核糖体结合位点 启动子 终止子 核糖体识别序列 操纵子序列及配套的调控基因 诱导性表达所需要的元件 多克隆位点复制起始序列 实验原理 用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 Tag 标签位于表达载体的多克隆位点的N端或者C端 能够与目的基因融合表达 N端或者C端融合表达 目前常用的标签有组氨酸标签 His Tag 谷胱甘肽S转移酶 glutathioneStransferase 标签 GST Tag 硫氧还蛋白 thioredoxin Trx 标签麦芽糖结合蛋白 MaltoseBindingProtein MBP 蛋白质A proteinA 纤维素结合位点 cellulosebindingdomain 标签等 一般对于小分子用较大的Tag 如GST 以获得稳定表达 而一般的基因多选择小Tag 如His 减少对目的蛋白的影响 实验原理 筛选标记 报告基因表达抗药性基因 Amp是最常见的筛选标记 kana 新霉素 四环素 红霉素和氯霉素 抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰 比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用 GFP 绿色荧光蛋白 是最常用的报告基因了 半乳糖苷酶 荧光素酶 一些融合表达Tag也有报告基因的功能 实验原理 常用表达载体pGEX系列载体是谷胱甘肽S 转移酶 GST 融合蛋白表达系统的载体 PtacPromoterAmppGEX KGpET系列的载体是His6融合蛋白的表达载体 T7KanapET 14b 实验原理 目的蛋白质的诱导表达lacIq Lactose lacI是大肠杆菌中lac操纵子 Operon 的调节基因 它所表达的阻遏蛋白是lac操纵基因 Operator 的抑制因子 抑制转录启动 当有乳糖存在时 这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制 使lac操纵子上的结构基因lacZ 半乳糖苷酶 lacY 透性酶 lacA 乙酰基转移酶 得以正常表达 启动转录 IPTG 异丙基 D 1 硫代半乳糖苷 作为乳糖的类似物与lacI阻遏蛋白结合而使操纵基因不被抑制 因此IPTG经常作为lac操纵子的诱导剂而使用 实验原理 实验原理 BamHI 酶切 NdeI 基因片段 酶切后的目的基因 酶切 连接 转化 筛选 蓝白斑 鉴定 PCR 酶切 测序 原核表达质粒的构建成功 原核表达的诱导条件IPTG浓度 0 01 5mmol L诱导时间 3h诱导温度 15 42 实验原理 目的蛋白质的纯化破碎细胞超声破碎溶菌酶裂解从细胞蛋白中纯化出GST和His融合蛋白GST可以通过谷胱甘肽 琼脂糖亲和层析进行纯化 由于GST对谷胱甘肽的亲和力非常高 因此可以利用谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白进行纯化 最后通过含有游离的谷胱甘肽的缓冲液 洗脱结合的GST融合蛋白 PolyHis多聚组氨酸能与多种过渡金属或过渡金属鳌和物结合 因此带HIS 6的蛋白能结合与固化的Ni2 树脂 用适当的缓冲液 PBS 洗冲洗去除其他杂蛋白后 再用可溶的竞争性鳌合剂 咪唑 洗脱可以回收靶蛋白 实验原理 目的蛋白质的检测蛋白质分子量的检测SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳目的蛋白质的分析 实验原理 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法 SDS是一种强阴离子型去污剂 能断裂分子内和分子间的氢键 使分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构 在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后 强还原剂例如 巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂 通过加热使蛋白质解离 解离后的氨基酸侧链与SDS结合形成带负电荷的蛋白质 SDS复合物 实验原理 蛋白质中加入SDS并加热 SDS分子上的非极性区 黄色尾巴 会与蛋白质上的非极性区结合 使蛋白质变性 成为一线状长条分子 上面布满SDS分子 SDS分子的极性区 洋红色圆点 则露在外面 以增加亲水性 SDS是一种阴离子表面活性剂 能打断氢键和疏水键 并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物 使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷 掩盖了各种蛋白质分子间的天然的电荷差异 SDS最终使蛋白质变成具有高负电荷的线状分子 97 0kDa 实验准备 诱导 培养37 恒温摇床电泳检测HoeferminiVEVerticalElectrophoresisSystem 仪器与设备 LB培养基 Amp IPTG30 丙烯酰胺贮液1 0MTris PH6 8 浓缩胶 1 5MTris PH8 8 分离胶 10 SDS 10 过硫酸铵 AP 四甲基乙二铵 TEMED 1XTris 甘氨酸电泳缓冲液 25mMTris 250mM甘氨酸 0 1 SDS1xSDS上样缓冲液 50mMTris HCl 6 8 100mMDTT 2 SDS 10 甘油 0 1 溴酚蓝染色液 90甲醇 90冰乙酸 20水 0 5gR 250脱色液 90甲醇 90冰乙酸 20水 实验试剂 实验步骤 培养诱导样品制备SDS PAGE凝胶检测 实验步骤 1 挑取单菌落 接入3ml含氨苄青霉素 50ug ml 的LB培养液 37 培养过夜 2 取50ul过夜培养物接入3ml含氨苄青霉素 50ug ml 的LB培养液 37 振荡培养2h以上 至对数中期 A600 0 5 0 6 3 吸出500ul未经诱导的培养物放在一个微量离心管中 室温高速离心1min 沉淀悬浮于100ul1xSDS凝胶加样缓冲液 100度加热3min 室温高速离心1min 冰上放置 4 在剩余培养物中加入IPTG至终浓度1mmol L 37 继续培养3h 取500ul样品放于微量离心管中 室温高速离心1min 5 沉淀悬浮于100ul1xSDS凝胶加样缓冲液 100度加热3min 室温高速离心1min 冰上放置 待全部样品处理完后上样 目的蛋白质的诱导表达及检测 6 将电泳槽玻璃板洗净 吹干 并用凡士林封边 安装好7 配12 分离胶 将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内 至凝胶槽高三分之二处 加蒸馏水密封 待胶凝固后 约需30min倒掉水 用吸水纸吸干8 配5 浓缩胶将配好的浓缩胶立即倒入凝胶槽内 以插入梳子不溢出为宜 插入梳子9 待胶凝固后 拔出梳子 放入电泳槽中10 制备好的样品加入上样孔11 连接电泳仪12 打开电源 调整电压至80V 待样品跑过浓缩胶 大约需30min 后将电压调至120V 待指示剂 溴酚兰 到达凝胶的底部距离下缘1cm时停止电泳 大约需2h 电泳结束 SDS PAGE 聚丙烯酰胺凝胶配制 miniVE 目的蛋白质的检测 考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝R250 coomassiebrilliantblue 是一种三苯甲烷纺织染料 又称酸蓝83 分子上含有两个S03H基团 偏酸性 能结合在蛋白质的碱性基团上 能够检测出大于0 1ug蛋白条带 将凝胶浸泡在染色液中 室温在摇床上缓慢染色4小时 或过夜 脱染 将染液回收 凝胶先用蒸馏水漂洗一次 浸入脱染液中脱染 室温浸泡凝胶或37 加热使其脱色 更换几次脱色液 直至出现清晰的电泳带为止 脱色后 将凝胶保存在水中或是20 甘油的水中 凝胶染色 作业 按要求认真撰写报告 包括实验目的 实验原理 实验材料 实验用品及药品 实验步骤 实验结果 阐述目的基因表达载体的构建 分析实验结果 包涵体的出现是目的基因的原核表达中常见问题 其发生原因是什么 如何解决 实验结果与分析 Thankyouforyourattention