植物细胞工程课件第四章细胞规模化培养技术.ppt

第四章细胞规模化培养技术 细胞工程电子课件 华中农业大学生命科学技术学院 概述 生物反应器的类型与特点 细胞规模化培养的主要技术环节 规模化培养中常见的问题与解决途径 主要内容 4 1概述 细胞规模化培养在现代工业中的潜力高等生物细胞规模化培养现状 4 1 1细胞规模化培养在现代工业中的潜力 在植物生物技术中 应用培养细胞系统合成有用的天然产物 很可能发展成为一个广义的化学工业的一个组成部分 长期以来 植物一直是许多化学品的主要资源 特别在制药和食品加工业中更是不可缺少 据不完全统计 至少有20 左右的药物是由植物衍生而来的 而且每年都可发现许多植物来源的新化合物 植物次生代谢产物在医药 食品 轻化工业等领域具有重要意义 李时珍 1593 在 本草纲目 中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物 目前仍有约25 的法定药品来自植物 其药物的有效成分均为次生产物 许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料 有些是生物毒素的主要来源 可以用于杀虫 杀菌 而对环境和人畜无害 是理想的环保产品 ProductsSynthesizedUsingCellCulture 引自Ramawat和Merillon 1999 ProductsSynthesizedUsingCellCulture 引自Ramawat和Merillon 1999 规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径 保护生态环境提高生产效率发展新型生物技术产业 来自于植物体和细胞培养的紫草宁含量比较 引自熊宗贵 1999 Examplesofenhancementinnaturalproductyieldinselectedcelllinescomparewithparentplantmaterial AfterFowler 1983 70年代后期 基因工程使得外源基因成功地在微生物中得以表达 由于其简单快速 生产效率高 逐渐形成了以原核细胞为培养对象的基因工程技术和大规模微生物培养技术 一度大有取代动物细胞培养这势 但许多生物活性蛋白不能在微生物工程菌细胞中表达 而只能在动物细胞中产生 也不能将蛋白质产物自动分泌到细胞外 给产物分离带来麻烦 80年代后 随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发展 已经能够把特定的外源基因通过PCR技术扩增几千倍 并可转染到动物细胞内 使其高效表达 动物细胞培养生产的各种产品是其他植物 微生物细胞培养所无法比拟的 在人类生活特别是医学中发挥越来越大的作用 4 1 2高等生物细胞规模化培养现状 1956年 Nichell和Routin提出了植物细胞培养生产化合物的第一个专利申请 20世纪60年代以来 组织培养的迅速发展为细胞培养奠定了技术基础 各种细胞培养基的设计 植物细胞生物反应器的研制 植物细胞培养动力学研究 植物细胞培养生产次级代谢物的调节控制理论与应用等方面的研究都取得了显著进展 1979年 国际组织培养协会专业术语委员会建议将组织培养和细胞培养的概念加以区分 以此为契机 20世纪80年代以来植物细胞培养进入了高速发展阶段 愈伤组织培养既属于组织培养又属于细胞培养 1983年 日本三井石油化学工业公司再世界上首次成功的采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁 此后 人参细胞培养生产人参皂苷 黄连细胞培养生产小檗碱 长春花细胞培养生产长春花碱 红豆杉细胞培养生产紫杉醇等相继取得成功 迄今为止 已经从400多种植物中分理出细胞 并通过细胞培养 获得600多种化合物 植物细胞大规模培养的技术要求 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和生产的生物反应器 建立最佳的控制和调节系统 从培养技术方面讲必须满足以下三个条件 培养的细胞在遗传上应是稳定的 以得到产量恒定的产物 细胞生长及生物合成的速度快 在较短的时间内能得到较高产量的终产物 代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解 最好能将其释放到培养基中 表 动物细胞培养的产物 一 植物细胞规模化培养过程的特点及对反应器的要求 与微生物细胞的差别抗剪切能力弱有聚集成团的趋势好气性操作周期较长 4 2生物反应器的类型与特点 总体上讲 适合植物细胞培养的反应器应该具有适宜的氧传递 良好的流动性和较低的剪切力 根据不同植物细胞生长和代谢产物积累特点 二 植物细胞反应器的类型与特点 植物细胞培养生物反应器 引自黄艳等 2001 一 机械搅拌式反应器 图4 1标准搅拌式生物反应器结构示意图 图4 2搅拌桨的类型 1 搅拌桨型式的改进 一般认为 涡轮状叶轮优于平叶轮 而平叶轮又优于螺旋状叶轮 因此采用适宜的搅拌桨类型和结构可使植物细胞的生长不受损害 最常用的是标准Rushton涡轮机 在高粘度培养基中 需要使用其他类型直径较大的叶轮 如大的搅拌桨及螺旋式叶轮 法国Inceltech公司成功地研制了带有倾斜刀片的涡轮 该结构提供了混合的轴向流和辐射流 Kaman等设计了带有一个双螺旋带状叶轮和三个表面挡板的搅拌罐 实验证明其适合于剪切力敏感的细胞高密度培养 钟建江等通过培养紫苏细胞进行比较 发现带以微孔金属丝网作为空气分布器的三叶螺旋桨反应器 MRP 能提供较小的剪切力和良好的供氧及混合状态 优于六平叶涡轮桨反应器 并认为在高浓度细胞培养时 MRP型反应器将显示更大的优越性 2 搅拌方式也会对剪切剪切作用产生影响 Hvoslef Eide等利用螺旋形搅拌式生物反应器对挪威云杉 Piceaabies 和桦树 Betulapendula 的体胚进行大量繁殖 发现在较低的搅拌速度下变换搅拌的方向可以降低剪切力 搅拌器的搅拌方向每10s变换1次时 30rpm的搅拌速度就可以有较好的混合性能 二 非机械搅拌式反应器 图4 3鼓泡式反应器结构示意图 鼓泡式与气升式反应器 鼓泡式反应器通过反应器底部的喷嘴及多孔板实现气体分散 促进液体流动 这种方式所提供的搅拌力要比搅拌式生物反应器柔和得多 于是混合可以在很低的剪切力条件下实现 但鼓泡式反应器对氧的利用率较低 2 气升式反应器 气升式反应器通过在鼓泡式反应器内部增加一个通气管而提高混合效率 气体在通气管轴部喷射 依靠这种方式传递动量和能量 通过上升液体和下降液体的静压差实现气流循环 以保证良好的传热和传质 并且不出现死角 流动形式比鼓泡式更均一 图4 4气升式反应器结构示意图 3 转鼓式反应器 转鼓式生物反应器是一种新型的反应器 它是利用转子的转动促进液体中溶氧与营养物的混合 通过应用不同反应器对烟草细胞悬浮培养的研究发现 相同条件下转鼓式反应器中细胞生长速率高 其氧的传递及细胞所受剪切损伤均优于气升式反应器 图4 5转鼓式反应器结构示意图 可以较容易地控制培养系统的理化环境 从而可以研究特定的代谢途径 并便于调节 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态 相互间接触密切 可以形成一定的理化梯度 有利于次生产物的合成 由于细胞固定在支持物上 培养基可以不断更换 可以从培养基中提取产物 免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制 也由于细胞留在反应器中 新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物 从而节省了生产细胞所付出的时间和费用 正是由于细胞固定在一定的介质中 并可以从培养基中不断提取产物 因此 它可以进行连续生产 三 固定化反应器 细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类 a 包埋式固定化培养系统 支持物多采用琼脂 琼脂糖 藻酸盐聚丙烯酰胺等 b 附着式固定化培养系统 支持物采用尼龙网 聚氨酯泡沫 中空纤维等材料 图4 6固定化系统示意图a 固定床反应器 b 流化床c 膜反应器 图4 8不同膜反应器的结构示意图a 单膜式平板膜反应器 b 双膜式平板膜反应器 c 多膜式平板膜反应器 d 管式膜反应器 三 植物细胞反应器系统的设计与控制 氧气的运输速率 OTR 由以下方程式给出 式中 液相运输系数 a 总界面面积 溶解氧的理论饱和浓度 任何情况下液相中实际测量的溶解氧浓度 一 氧气供应 图4 9氧气的运输过程及反应器中运输的界限 二 光照系统的增设 考虑 光源的安装 光的传递 反应器供气混合的影响等 小规模实验 可采用外部光照的方法大规模生产 着手研究内部光源反应器 三 培养控制 四 动物细胞规模化培养生物反应器 一 经典的动物细胞培养反应器 搅拌式生物反应器 Stirredtankbioreactor 2 气升式反应器 Air liftbioreactor 4 填充床反应器 Packedbedbioreactor 3 流化床反应器 Fluidizedbedreactor 中空纤维反应器 Hollowfiberbioreactor 供氧方式的改进 搅拌式生物反应器 Stirredtankbioreactor 图4 10Spier设计的笼式通气装置 图4 11CelliGen笼式通气搅拌器 图4 12CelliGen细胞培养罐 图4 13CellCul 50 细胞培养反应器 搅拌桨的改进反应器中的搅拌桨主要有两种类型 一种是放射向流叶轮 一种是轴向流叶轮 在动物细胞培养中宜采用轴向流搅拌桨 使流体流动的方向平行于轴向 图4 12两种搅拌桨的形状 图4 15两种搅拌桨产生的流动情形 1979年 Katinger等人首次应用气生式生物反应器进行动物细胞悬浮培养 英国Celltech公司是应用气升式生物反应器进行动物细胞大规模培养的成功范例 1985年应用100L规模的气升式生物反应器大规模培养杂交瘤细胞 目前已开发出10000L规模的气升式生物反应器用于各类单抗的大量生产 2 气升式反应器 Air liftbioreactor 图4 16气升式反应器类型 a 内循环式 b 外循环式 3 流化床反应器 Fluidizedbedreactor 图4 17流化床结构示意图 4 填充床反应器 Packedbedbioreactor 图4 18CelliGenPlus填充床反应器 中空纤维反应器 hollowfiberbioreactor 图4 19中空纤维管扫描图片及其反应器示意图 实验室规模反应器 工业规模反应器 100L 500 000L Processcontrolandmonitoring Processparameterstobemonitors Sugarconsumption pH Temperature Fermentationtime h Agitation CellDryWeight Product Computersoftwareshavebeendevelopedtomonitorandchangetheprocessonline 二 新型动物细胞培养反应器 图4 20CellCube贴壁细胞培养系统 CellCube细胞方块 图4 21摇袋式细胞培养生物反应器工作示意图 旋转式细胞培养系统 therotarycellculturesyetem RCCS 摇袋式细胞培养生物反应器 WaveBioreactor 三 反应器培养中的关键问题及解决途径 搅拌桨设计加设导流筒减小气泡尺寸供氧方式的改变 4 3细胞规模化培养的主要技术环节 种子细胞的繁殖与培养系统的建立 细胞规模化培养与调控 目的产物的分离与纯化 4 3 1种子细胞的繁殖与培养系统的建立 种子细胞选择 外植体选择 高产细胞选择 植物类型 植物细胞的遗传基础是天然产物生产的基本影响因素 不同植物产生的天然产物种类之所以不同 从根本上来说是因为它们具有不同的遗传基础 在确定生产某一种化合物以后 首先必须准确选择那些能够产生目的化合物的植物种类及其品种或单株 组织器官 由于天然产物一般为次生代谢产物 而植物次生代谢产物的积累具有组织器官特异性 因此 在起始细胞培养时应尽量选择自然状态下产生天然产物的器官 组织为外植体 部分代表性植物次生产物及其植物资源 引自Ramawat和Merillon 1999 有效成分分析 悬浮细胞系 单细胞克隆 种细胞增殖 在大多数情况下 来自起始材料的细胞系通常是一个异质细胞群体 细胞间在次生产物积累能力上有很大差异 为了提高筛选效率 还可根据后续的培养条件适当增加选择压力 也可采用一些突变的方法进行高产突变细胞系筛选 种子细胞增殖与放大培养 种子细胞的增殖与放大培养 是建立细胞规模化培养体系的中间环节 目的之一是要获得大量的活跃生长的细胞群体 为细胞大批量生产准备基础材料 目的之二是为大体积反应器培养提供技术参数 大规模培养体系的建立 成批培养 连续培养 半连续培养 在一个培养体积中接种细胞和添加培养基后 中途不添加培养基也不更换培养基的方式 其细胞生长动态与实验室摇瓶培养一致 成典型的 S 生长曲线 在一个培养周期中 当细胞生长进入缓慢生长达到静止期时 往往是细胞次生代谢产物积累的时期 此时应尽可能维持细胞活性 延长生产周期 以便获得较高的产物积累 成批培养 batchculture 成批培养的优点是培养装置和操作简单 但在培养过程中细胞生长 产物积累 以及培养基的物理状态常常随时间变化而变化 培养检测十分困难 同时 成批培养的周期较短 一个培养周期后细胞和培养液同时取出用于目的产物提取 下一个培养周期必须重新接种种子细胞 因此也增加了培养成本 在培养的过程中 不断向反应器中以一定的流量添加新鲜培养基 同时以相同的流量从系统中取出培养液 从而维持培养系统内在细胞密度 产物浓度以及物理状态上的相对平衡 连续培养 continuousculture 这种培养最大的优点是可以延长细胞培养周期 从而延长目的产物的积累时间 增加目的产物产量 同时 由于系统进入稳定状态后 细胞密度 基质及产物浓度等趋于恒定 因而便于对系统的检测 但连续培养装置相对较复杂 对反应器的设计要求较高 这是一种介于成批培养和连续培养之间的培养方式 其基本方法是在完成上述成批培养的一个周期后 只从反应器中取出大部分细胞悬液 保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞 然后加入新鲜培养基进行培养 半连续培养 semi continousculture 这种培养方式可以节省种子细胞培养的成本 同时保留的培养液也有利于细胞分裂启动 但在大多数情况下 由于保留细胞悬液中细胞状态有较大差异 特别是有些衰老细胞不能及时淘汰 从而会影响下一培养周期的细胞生长一致性 4 3 2细胞规模化培养与调控 规模化细胞生产的重要因素是过程调控 反应器类型的选择接种体积细胞和环境之间的关系 反应器类型的选择 在大的生物反应器中氧气 二氧化碳及其他气态代谢物在气相与液相之间的传递 营养物和溶解气体的均匀分布很难实现 混合 质量传递和热传递可用的操纵方法是通气和搅拌 该方法受到物理 生物 力学等条件的限制 通气和搅拌太剧烈时流体的压力会破坏细胞 细胞浓度和传递现象之间存在着相互作用 培养后期细胞浓度很高 细胞尺寸增大 分泌到细胞外的多糖增多 培养体系变得相当黏稠 规模放大策略就是应用大规模细胞培养的控制机理 操纵通气和搅拌使过程最优 在搅拌式反应器内可控制通气和搅拌 在气升式反应器内可消除搅拌产生的流体压力 越来越多的新型反应器应用于低剪切力下高密度培养植物细胞 这些反应器的开发和放大与传统的搅拌式和气升式反应器相比仍处于初期 接种体积 细胞生长需要一定量的接种体积 最小接种体积一般要比培养体积的10 多 临界接种体积的研究较多 但一些研究表明接种时用过的培养基会刺激细胞生长 当接种的废培养基用水代替后 细胞培养的迟滞时间会延长 最大生长速率会降低 临界接种密度与细胞内一些重要代谢物的生产有关 除了接种浓度 接种细胞的生理状态也会影响培养周期 例如 当接种长春花新生的分裂细胞时 达到最大细胞浓度的时间缩短了 而且与生长相关的生物碱产量提高了 细胞和环境之间的关系 混合时间混合时间定义为将液体混合到特定的均一程度时所需的时间 取决于气体流动速率以及液体内的气体分率 搅拌速度 反应器的尺寸和培养液的流变学特性 通气气流速率大对细胞生长的副作用主要是剪切力增大造成的 同时通气的消极影响还包括CO2和其他关键的气体代谢物的去除 因为CO2含量过高也会产生负效应 搅拌增加搅拌速度可以降低混合时间 另外 搅拌速度是流动压力的主要来源 静力学压差生物反应器尺寸增大 釜内顶部和底部之间的静力学压差增大 静力学压差影响质量传递过程 静力学压差大最主要的结果是增加了气体的溶解度 气液和液气之间的传质推动力增大 温度控制和热量泡沫细胞培养通气会产生泡沫 培养的细胞容易转移到泡沫层 在培养液上层生成了固体膜 这层膜能显著降低细胞浓度 应尽量避免 这层膜内的细胞容易缺乏营养 营养限制可导致细胞死亡 细胞组分分泌到培养液里可能产生副作用 4 3 3目的产物的分离与纯化 动物细胞大规模培养方法 1 悬浮培养 suspensionculture 适用于非贴壁依赖性细胞 也可用于兼性贴壁细胞 其操作方法与植物细胞悬浮培养相似 该方法的优点在于操作简便 培养条件比较均一 传质和传氧条件较好 容易扩大培养规模 培养成本相对较低 不足之处是难以采用灌注培养方式 因此细胞密度较小 目的产物产量较低 悬浮培养的设备亦包括通气搅拌式和气升式反应器 目前较为成熟的设备产品主要有 英国Wellcome公司的8000L搅拌罐式反应器 他们用于Namalwa培养生产 干扰素 英国Celltech公司的2000L气升式生物反应器 目前他们用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体 贴壁培养是让细胞贴附于适当基质上进行增殖培养的方法 它适用于一切贴壁依赖性细胞以及兼性贴壁细胞 其优点是可以采用灌流式操作方式使细胞目的大大提高 但操作比较复杂 规模放大培养比较困难 且继代时需要采用适当的方法将细胞和从基质上剥离下来 2 贴壁培养 anchorage dependentculture 1967年荷兰的vanWezel首先采用葡聚糖SephadexA50微小颗粒培养贴壁细胞成功 由此开创了微载体细胞培养的新纪元 3 微载体培养 microcarrierculture 优点既可以创造相当大的贴附面积 满足细胞贴壁生长增殖 又由于载体体积小 比重轻 轻度搅拌即可使微粒带动细胞悬浮在培养基中 从而充分发挥悬浮培养的优点 微载体的特性对细胞和人体健康无毒害因子 便于细胞附着 伸展和增殖 化学性质稳定 不与培养基成分发生反应 比重轻 质地软便于搅拌操作并使细胞避免磨擦损伤 透明性好 便于在显微镜下观察 已商品化的微载体 生长在载体上的动物细胞 收获细胞 包埋培养与微载体培养的不同之处在于微载体是让细胞附着 而包埋是将细胞包裹在载体的里面 如果包埋的凝胶载体较大 有时也称之为巨载体培养 macrocarrier 4 包埋 entrapment 和微囊 microencap sulation 培养 微囊培养是在包埋培养的基础上发展起来的 即将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊 使其更利于细胞生长和产物积累 包埋材料 人工合成材料 如聚丙烯酰胺 环氧树脂 聚丙烯甲酸酯 聚乙烯醇等 糖类 如纤维素 琼脂 海藻酸钙等 蛋白质类 如胶原 明胶 纤维蛋白等 包埋或微囊培养的优点 避免细胞在搅拌中的伤害 便于产品在微囊中浓缩 有人报道 微囊内的抗体浓度可达1250 5300mgl 1 可增大细胞密度至107 108ml 1以上 从而增加了培养效率 1980年 Tolbert首先利用有些正常需要贴附于基质表面的细胞具有形成细胞团的特点 用搅拌式反应器和灌注培养的方式获得了高密度的细胞 从而开创了细胞结团培养的新方法 5 结团培养 aggregateculture 该方法的实质是用细胞本身作为基质 相互贴附 再用悬浮的方法进行培养 在实际应用中 为了加速细胞结团 可先在培养基内加入一些小微粒 20 m 促使细胞先附着其上 在细胞增殖中再相互附着 该方法与微载体培养的区别是 微粒小 细胞不能在载体上伸展 相互贴附的细胞呈球形 其优点是操作简单 节省了大量的微载体 4 4规模化培养中常见的问题与解决途径 植物细胞的体积大 其平均直径比细菌大几十倍 同时 植物细胞很少以单细胞形式悬浮生长 通常是以2 200个细胞 直径2mm大小的非均相小细胞团方式存在 植物细胞生长速度慢 因此操作周期长 一般均在3 8周 加之植物细胞培养的培养基营养成分复杂 有利于微生物生长 因此植物细胞培养中维持无菌环境难度较大但又十分重要 植物细胞的纤维素细胞壁虽然使植物细胞具有很强的抗张强度 但却使其抗剪切能力相当弱 1 悬浮培养系统必须适应植物细胞特性 植物细胞培养液的流变特性常用粘度来描述 培养过程中培养液的粘度变化可由细胞密度和细胞分泌物以及细胞状态引起 eg 烟草培养液的表观粘度培养过程中主要是由培养细胞密度的增加引起的 当细胞密度低于7g l 1时 培养液的粘度基本保持不变 而当细胞密度高于此值时 培养液的粘度即增加 2 植物细胞培养液的流变特性 长春花细胞培养 当细胞密度在10g l 1时 培养液属于假塑性流体 此时 培养液的粘度依赖于细胞年龄 形态和细胞团的大小 在相同物质浓度下 大细胞团的营养液表观粘度明显大于小细胞团培养液的表观粘度 Kla 单位时间 单位体积氧量 如在4L的气升式反应器中进行长春花细胞培养时 KLa在20h 1左右时 细胞生长与次生产物合成均维持在良好状态 又如在15L的通风式反应器中培养的烟草细胞 当KLa值在5 10h 1的范围内 随着KLa的增加 生物量和代谢产物也呈线性增加 3 植物细胞培养过程中的氧体调节 溶氧浓度 曾在不同氧浓度下对毛地黄细胞培养进行培养 结果显示 当培养基氧浓度从10 饱和度上升至30 时 细胞的生长速率从0 15d 1上升至0 20d 1 如果溶氧浓度继续上升至40 饱和度时 细胞生长速率反而下降至0 17d 1 植物细胞能非光合地利用CO2 如在通气调节过程中 混入2 4 的CO2即能消除高通气速率对长春花细胞生长和产生代谢产物的不利影响 总之 对于植物细胞规模化培养来讲 在要求培养基充分均匀的同时 O2和CO2的浓度必需达到某一平衡状态 4 植物细胞培养过程中的CO2调节 植物细胞大规模培养中易产生大量的泡沫 且覆盖有蛋白质和粘多糖 因而粘性大 细胞极易被包埋在其中从循环的培养液中带出来 形成非均相培养而影响培养系统的稳定性和生产率 控制泡沫的方式目前通常采用化学和机械两种方法 5 泡沫和表面粘附性 化学消泡剂必需满足以下条件 具有较低的表面张力和一定的亲水性 以使消泡剂对气 液界面的分散系数足够大 消泡作用迅速有效 化学性质稳定 在水中的溶解度小 不与次生产物起任何化学反应 对植物细胞无毒害 不影响气体在营养液中的传递和溶解 来源方便 价格便宜 常用的化学消泡剂包括天然油脂类 高级醇类 聚醚类和硅酮类 实际应用中必需根据所培养的植物种类 次生产物特性具体选择 机械消泡是靠机械装置实现的 其优点是勿需在培养液中加入其它物质 从而减少了由于消泡剂所引起的污染和对后续分离工艺的影响 但机械消泡效果常不如化学消泡迅速彻底 同时机械消泡也会增加培养装置的复杂性 植物细胞规模化培养中的另一个问题是 细胞往往会粘附于培养液表面以上的器壁上 或电极的挡板上使这些细胞脱离于培养液造成细胞死亡 培养液表面以上的细胞可采用机械去除 电极上的细胞多采用在电极上涂布硅油以防止细胞粘附 由于对生物反应器内生物特征及传递特性认识得不够深入 迄今为止反应器的放大仍是经验与技巧 基础实验与理论研究远远落后于实用化的进程 选择反应器首先要考虑的是比较低的剪切耐受力 用于植物细胞培养的生物反应器必须在微生物反应器基础上进行改造或重新设计 植物细胞反应器的设计必须具备合适的氧传递 良好的流动特性和低的剪切力 6 反应器的设计与放大 培养方式的选择加强计算机用于细胞培养过程控制的研究加强多学科的协作后续分离提取技术的研究和提高成本考虑等 7 其他