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外科学与分子生物学Surgery molecularbiology 于颖彦上海消化外科研究所 Definition 是在分子水平阐述核酸与蛋白质 蛋白质与蛋白质的相互作用 阐述基因表达与调控机理的科学 DNA分子双螺旋结构 goldenhelix Crick 物理学家 Watson 生物学家 Nature 19531962年荣获诺贝尔生理学与医学奖现代分子生物学诞生 DNA deoxyribonucleicacid 是具有保存 复制信息 并可在细胞与细胞之间 亲代与子代之间传递信息的生物大分子结构 两条缎带样结构盘绕成梯形双螺旋结构 呈致密线圈状存在于细胞核的染色体内 缎带结构是核糖与磷酸构成的骨架 内部阶梯是碱基对碱基对 A T C GA adenineT thymineC cytosineG guanine DNA的半保留复制 子代DNA双链一条来自亲代 另一条为新合成的互补链 子链是母链的准确抄本 由此构成了遗传保守性 DNA半保留复制 分子生物学中心法则centraldogma DNA指导RNA合成 RNA指导蛋白质合成 而特异性蛋白质又反过来催化DNA RNA合成 DNA的每条单链由很多字母组成 ATGCTCGAATAAATGTGAATTTGA以上字母组成多个词 ATGCTCGAATAAATGTGAATTTGA以上单词构成了句子 ATGCTCGAATAA ATGTGAATTTGA 以上句子就是基因基因 是负载特定遗传信息的DNA分子片段 是编码一个RNA分子所必须的DNA序列 RNA是充当DNA与蛋白质合成间的信使 DNA发布制造蛋白质 Protein 的命令 基因组 genome 构成细胞DNA的大约60亿个碱基 组成的全套基因 除了同卵双胞胎外 每个各体碱基序列均不相同 使得每一各体都有各自的特点 染色体 chromosome 是基因的载体 人类体细胞含46条染色体 44条为常染色体 另两条为性染色体 在女性为XX 男性为XY 突变 Mutation 即构成基因的DNA字母发生改变 Genemutation Genemutation 单核苷酸多态性 singlenucleotidepolymorphism SNP即构成基因的DNA字母发生改变 与基因突变的差别在于 突变在群体中的发生频率小于1 而多态性在群体中的出现频率大于1 Geneexpression 真核生物的基因 由编码序列和非编码序列组成 前者称为外显子 exon 后者称为内含子 intron 两者相嵌排列 内含子被切掉后外显子拼接起来转录为基因产物 每一个基因首位和末位外显子外侧均有一段不被转录与翻译的非编码区 参与转录与翻译的调控 此区含有与RNA聚合酶结合并启动基因转录的启动子 promotor 使基因高效转录的增强子 enhancer 使转录终止的终止子 terminator Regulationofgeneexpression 基因的转录调控 外科分子生物学的提出 20世纪80年代外科已能有效的控制创伤与感染外科研究的主体转向肿瘤研究外科的优势 最易获得人类肿瘤材料 研究内容细胞增殖与凋亡Cellproliferationandapoptosis肿瘤为主要研究对象 揭示细胞周期失控的类型与机制 为分子诊断与基因治疗提供依据目标外科疾病的基因诊断与基因治疗 原癌基因 protooncogene 原本存在于正常细胞中 表示C myc癌基因 oncogene 具有使正常细胞转化为肿瘤的基因 或称transforminggene 由小写字母表示 如myc肿瘤抑制基因 tumorsupressorgene抗癌基因 antioncogene他们的失活或功能丢失 使细胞周期失去负性调控 正常细胞转变为肿瘤细胞 Oncogene Tumorsuppressorgene DNA损伤 生物体的内外环境可造成DNA损伤 引起碱基序列改变或断裂 若不加以纠正 则将转录翻译出错误蛋白质 是衰老 疾病 癌症发生的原因 肿瘤抑制基因功能丢失 肿瘤是一类细胞周期疾病 cellcycledisease 细胞周期的调控 应用 肿瘤的发病机制研究 肿瘤发病机制研究 肿瘤是多步骤多基因突变的疾病 基因诊断 以探测基因存在 分析基因类型和缺陷以及功能是否正常从而达到诊断疾病的方法1 核酸分子杂交根据碱基互补原则 利用核苷酸单链作为分子探针检测待测基因的过程 Southernblot northernblot dotblot insituhybridization FISH2 聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 由DNA聚合酶催化 利用极微量DNA片段扩增 经过多个循环周而复始 使目的DNA片段达到扩增3 DNA芯片技术在固相膜片上制成成千上万个寡核苷酸点阵 以待测样本DNA RNA用荧光标记后与之杂交 利用激光共聚焦显微镜对芯片扫描 计算机进行信息分析 1 人类基因组计划 humangenomeproject HGP由美国科学家提出 目的是将细胞内基因组DNA序列全部分析出来 美国1990年正式启动 英 法 德 日 中等国科学家共同参与 2003年4月已宣布完成人类基因组序列图 后基因组计划或功能基因组学 post genomeproject functionalgenomics研究基因组中各基因的功能 目前已知功能的基因仅占小部分 大量基因功能尚待阐明 Homogenization PCR polymerasechainreaction 是在模板DNA 引物 四种脱氧核苷酸 dNTP 存在条件下由耐热DNA聚合酶在体外酶促合成双链DNA反应 其特异性取决于引物和模板DNA的特异性 PCR PCR PCR Southernblot Insituhybridization Microarray Genediagnosistechnique microarray 基因治疗 genetherapy 指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用 向免疫细胞导入细胞因子基因 增强机体免疫功能 包括肿瘤坏死因子类 干扰素类 白细胞介素类 基因增补 导入主要组织相容性复合物抗原基因 MHC 提高肿瘤抗原性 诱导特异性细胞毒性杀伤作用导入抑癌基因 如野生型P53基因 诱导肿瘤凋亡并丧失致瘤性遏制癌基因的表达 采用反义核苷酸序列在癌基因表达时与mRNA特异性结合 以阻遏癌基因表达 基因封闭 导入自杀基因 将某些病毒 细菌中的前药转换酶基因 自杀基因导入癌细胞 自杀基因编码的酶类将药物前体在癌细胞内转换为毒性产物 达到杀伤肿瘤目的 外科学与免疫学Surgery immunology 免疫系统的组成 免疫系统 immunesystem 参与免疫应答 执行免疫功能的独立解剖学结构 包括免疫器官 免疫细胞和免疫分子Thymus bonemarrowLymphnode spleen mucosaassociatedlymphoidtissue MALT T Blymphocyte naturalkillercell antigen presentingcellImmunoglobulin complement cytokine adhesionmolecule MHC HLA 免疫系统组成 免疫应答的基本机理 免疫应答是由多种免疫细胞和免疫分子参与的复杂过程 根据参与主要免疫细胞的不同分为T细胞介导的细胞免疫应答和B细胞介导的体液免疫应答 免疫应答效应可保护机体免受抗原异物的侵害 但某种情况下也可导致自身组织的损伤免疫应答三时相 识别相 激活相 效应相 T细胞介导的细胞免疫效应机制 CD8 Tcell活化需要双信号 TCR特异性识别MHCI分子 抗原肽复合物 共刺激信号或第二信号 CD4 T细胞分泌的细胞因子T细胞杀伤靶细胞效应细胞与靶细胞结合 杀伤 颗粒胞吐机制 穿孔素 颗粒酶 丝氨酸酯酶等 受体介导机制 Fas FasL途径 TNF途径 B细胞介导的细胞免疫效应机制 巨噬细胞加工抗原B细胞识别抗原决定簇抗原肽 MHCII分子复合物 第一信号 Th细胞活化产生多种细胞因子 第二信号 B细胞增殖 分化为浆细胞 产生免疫球蛋白 antibody MHC基因 Dendriticcellandtumorantigen NK细胞介导的细胞免疫效应机制 特点 无须抗原刺激 无MHC限制 不依赖抗体 为自然杀伤性质识别靶细胞 与靶细胞膜结合的IgGFc段 LFA 1与靶细胞膜ICAM 1相互作用杀伤靶细胞 穿孔素 颗粒酶机制 TNF机制 NK细胞毒因子 免疫记忆机制 immunologicalmemory 机体对胸腺依赖性抗原再次刺激时表现出比初次刺激更为强烈的应答反应 需要T B细胞的共同参与T细胞免疫记忆 终生存在 即初次免疫应答结束后有长寿性记忆T细胞存活 滤泡树突状细胞可持续低水平保持抗原B细胞免疫记忆 与T细胞免疫记忆相似 初次应答后有长寿性记忆B细胞存活 需要滤泡树突状细胞可持续低水平保持抗原及抗原特异性CD4 T细胞协调 免疫调节 immuneregulation 指机体多种因素对免疫应答过程的正负调节作用 以使免疫应答适度 维持内环境稳定例如APC表面MHC分子与黏附分子具有调节作用可溶性免疫分子具有调节作用Fas FasL系统具有调节作用 免疫调节 以抗感染免疫为例 抗感染免疫是机体识别 清除病原体的生理性防御机制 免疫学基本理论是建立在感染免疫基础上抗感染免疫特点 天然免疫和获得性免疫共存 病原体不同 免疫机制也不同 病原体可发生免疫逃避或抵抗 不恰当的免疫同样引起损伤与疾病天然免疫 各种屏障 吞噬细胞 NK细胞 补体 细胞因子等获得性免疫 T细胞免疫应答 B细胞免疫应答 免疫记忆 immunologicalmemory 感染的免疫效应机制 感染 免疫效应机制 抗感染免疫 肿瘤免疫学 tumorimmunology 研究肿瘤的免疫源性 机体免疫功能与肿瘤发生发展关系 机体抗肿瘤效应机制以及免疫诊断和免疫治疗的科学肿瘤抗原是恶性转化细胞中出现的蛋白与多肽分子总称肿瘤特异性抗原 tumor specificantigen TSA 指正常细胞不存在 肿瘤细胞所独有的抗原 如黑色素瘤抗原基因产物 melanoma antigen encodinggene MEGE 肿瘤相关抗原 tumor associationantigen TAA 指可存在于正常细胞或胚胎组织 肿瘤细胞表达增高 如AFP CEA CA19 9等 Tumorantigen Tumorimmune 抗肿瘤免疫应答 细胞免疫占主导地位 体液免疫起一定作用 NK细胞起一定作用 肿瘤的免疫治疗 immunotherapy机理 提高肿瘤免疫源性 激发机体抗肿瘤免疫应答能力 免疫治疗分类 主动免疫疗法 activeimmunotherapy 即激活机体抗肿瘤免疫能力 如毒或灭活瘤苗 基因修饰瘤苗 肿瘤抗原肽疫苗等被动免疫疗法 passiveimmunotherapy 即向宿主转移有抗肿瘤活性的治疗因子或细胞 如单克隆抗体 抗体偶联物 淋巴细胞 TNF等 主动免疫疗法中肿瘤抗原的制备 肿瘤细胞作为疫苗 加热 冻融 放射线照射等处理 使瘤细胞灭活 保持抗原性 以非特异性刺激因子作为左剂联合注射于患者体内进行主动免疫治疗抗原肽作为疫苗 生化技术纯化肿瘤细胞抗原肽或依据肽序列人工合成抗原肽 结合MHCI分子作为疫苗 肿瘤免疫治疗 肿瘤的免疫监视与免疫逃逸 免疫监视 immunesurveillence 指机体免疫系统可以识别并消灭表达新抗原的 异己 成分或突变细胞 保持机体内环境稳定免疫逃逸 immuno evasion 指机体免疫系统无法识别 消灭突变的细胞 是肿瘤进展 转移的基础原因 肿瘤抗原性低下 MHCI类分子表达减少 缺乏 肿瘤细胞自分泌免疫抑制因子TGF IL 10 宿主T细胞发育或功能缺陷 宿主血清中的封闭因子 免疫豁免 即肿瘤细胞表达FasL 引起CTL凋亡 Transplantrejection 同种异体器官移植排异反应产生机制 排异反应 由受体免疫系统识别供体的异体抗原引发的一系列免疫反应 最终造成移植器官的功能丧失 MHC MajorHistocompatibilityComplex 主要组织相容性复合物 在人类指HLA HumanLeucocyteAntigen 人类白细胞抗原 HLAI类抗原可出现在大多数有核细胞 而HLAII类抗原仅见于抗原递呈细胞 AntigenPrensentingCell APC 如树突状细胞 单核细胞和B淋巴细胞 临床抗排异治疗药物的作用机制 几种免疫抑制剂特性以及作用靶点 名称特性作用靶点 环孢霉素A CsA 土壤真菌提取物抑制NF AT 阻断T细胞激活和分泌细胞因子 cyclosporine FK506丝状菌提取物抑制NF AT 体外抑制活性为CsA的100倍 tacrolimus 硫唑嘌呤 AZa DNA代谢抑制剂抑制淋巴细胞增殖分化 azathioprine 类固醇肾上腺皮质激素抑制巨噬细胞 清除循环中的T细胞使其回归淋巴结 corticosteroid OKT3T细胞靶向单克隆抗体清除循环中的T淋巴细胞 器官移植 organtrnasplatation 移植免疫学 transplantationimmunology 在异种移植免疫排斥反应中 体液免疫占主导地位 而同种异体器官移植排斥反应中 细胞免疫反应占主导地位 同种异体器官移植排斥反应的T细胞激活有两种方式 直接激活和间接激活 移植免疫 移植免疫