《siRNA和miRNA》PPT课件.ppt

第五章siRNA和miRNA介导的调控 20世纪50年代中期 人类发现生命的遗传物质是DNA双螺旋 这之后过了十多年 人们才发现了RNA 它们是联系DNA和蛋白质的 桥梁 是细胞里的信使 信使RNA 运输工具 转运RNA 和 车床 核糖体RNA 上的关键零件 因此它们看起来好像一直在默默地干着一些替DNA跑腿的杂活 长久以来 生物学家们从来没有认为RNA会是生命中最重要的一份子 越来越多的证据清楚的表明 RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要 TraditionalRNAs RNA的分类 细胞核和胞液线粒体功能 核蛋白体RNArRNAmtrRNA核蛋白体组成成分信使RNAmRNAmtmRNA蛋白质合成模板转运RNAtRNAmttRNA转运氨基酸不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前体小核RNAsnRNA参与hnRNA的剪接 转运小胞浆RNAscRNA 7SL RNA蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分 近些年来 人类发现了许多不同种类的RNA分子 其中最为重要的是小RNA分子的发现 有些小RNA分子能直接调控某些基因的开关从而控制细胞的生长发育并决定细胞分化的组织类型 在2001年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首 随着对小分子RNA研究的不断深入 研究人员开始认识到 小分子RNA的世界一点都不小 有人推测 小分子RNA可能代表一个新层次上的基因表达调控方式 小RNA分子本身又包含了若干类RNA 根据小RNA的生成 结构和功能大约可分为以下几类 RNAi的研究历程 2020年2月19日 8 1995 RNAi现象首次在线虫中发现 1998 RNAi概念的首次提出 1999 RNAi作用机制模型的提出 在线虫 果蝇 拟南芥及斑马鱼等多种生物内发现RNAi现象 2001 RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象 RNAi技术被 Science 评为2001年度的十大科技进展之一 至今 蓬勃发展 成为分子生物学领域最为热门的方向之一 2020年2月19日 8 内容纲要 一 RNA干扰及其机制二 MicroRNAs在发育中的调控作用三 RNAi与异染色质四 miRNA在癌症发生中的作用五 siRNA的应用 2020年2月19日 10 RNA干扰 RNAi 是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制 将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA doublestrandRNA dsRNA 导入细胞后 能特异性地降解该mRNA 从而产生相应的功能表型缺失由于RNAi发生在转录后水平 所以又称为转录后基因沉默 post transcriptionalgenesilencing PTGS RNA干扰是一种重要而普遍表观遗传的现象 2020年2月19日 10 一 RNA干扰及其机制 RNA干扰的发现 1 1990年 RichJorgensen将由强启动子控制的Chalconesynthasegene转入淡紫色的矮牵牛花 加深紫色2 Hypopigmentation 许多花出现杂色 甚至紫色消失 变成白色3 Co suppression RNA干扰 线虫 1 1995年 SuGuoandKennethJ Kemphues 线虫2 利用反义RNA技术阻断线虫中的par 1基因 在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强 3 然而 正义RNA和反义RNA都能够有效地抑制基因的表达 4 沉默的效应能够在被注射的动物及其后代中保持 虽然RNA转录本在胚胎早期就发生降解 双链RNA与其序列同源的基因的表达 RNA干扰 1 RNAInterference 注入dsRNA能够有效地 长期的阻断基因的表达2 给线虫喂食表达GFPdsRNA的细菌 线虫的GFP表达被抑制 a 但存在RNAi缺陷的则不被抑制 b 3 之前的正义RNA抑制基因表达的现象 可能是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起 植物免疫系统 1 植物细胞可以通过降解病毒RNA的方式来对抗病毒的入侵 称为转录后沉默 PTGS 2 外源基因诱导的RNA沉默是植物对抗病毒和转座子的一个防御系统3 绝大多数的植物病毒具有单链RNA基因组 进入细胞之后从释放其基因组 由病毒编码的RNApolymerase产生正义和反义的RNA 并形成dsRNA 触发RNAi机制从而抵制其自身的序列 RNA干扰的过程 1 从双链RNA产生的小干扰RNA可以用不同机制关闭基因的细胞机器2 为什么外源的dsRNA能够抑制与其序列同源的基因的表达 RNA干扰的分子机器 1 Dicer RNaseIII类似的 包含多个功能结构域的核糖核酸酶 将dsRNA切割成小的shortinterferingRNAs siRNAs ormicroRNAs miRNA 并将这些产物加载到RISC上2 RISC RNAinducedsilencingcomplexes RNA诱导的沉默复合体 包含多个蛋白质的复合物 将与之连接的siRNA或miRNA定位到其靶点并抑制靶基因的表达 Dicer 序列的结构组成 1 一个PAZ结构域 与dsRNA的末端结合2 两个RNaseIII结构3 其他的功能结构域 Dicer 1 PAZ有一个OB折叠 与ssRNAs的3 端有较弱的亲和力 允许PAZ与dsRNAs露在外面的两个核苷酸结合2 Dicer的PAZ结构域能够识别Drosha切割的产物末端 Dicer的三级结构 1 PAZ结构域与两个具有催化活性的RNaseIII结构域分离2 PAZ结构域与RNaseIII结构域的距离为65A 与25个bp的RNA长度一致3 Dicer是一个分子尺 负责识别dsRNA并在特异位点切断 RISC Argonaute AGO RISC的核心成员 1 Argonaute AGO 大的蛋白质家族 为RISCs的核心成员2 AGO蛋白质一般包含PAZ和PIWI两种功能结构域3 PAZ与双链siRNA3 端露出的两个核苷酸结合4 PIWI负责将双链siRNA切成单链5 PAZ和PIWI对于siRNA与底物mRNA之间的相互作用是必须的 并负责底物的断裂或转录抑制6 不同的AGO具有不同功能 例如人类AGO2负责的RISCs能够割裂底物mRNA 而AGO1和AGO3则不能 siRNA介导的mRNA割裂 RISC的加载与激活 RNA干扰 1 dsRNA首先需要被Dicer相关的复合物进行处理 然后在Argonaute相关的复合物的引导下发挥功能 2 Dicer和Argonaute家族的成员在RNA诱导的沉默通路中发挥功能 不同的组成通过不同的机制引起沉默3 例如 不同的Argonaute相关复合物能够引起不同的沉默过程 mRNA降解vs 翻译抑制 小干扰RNA smallinterferingRNA siRNA 和微小RNA microRNA miRNA 是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子 是小RNA的最主要组成部分 它们的相关性密切 既具有相似性 又具有差异性 对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘 27 miRNA结构 21 25nt长的单链小分子RNA 5 端有一个磷酸基团 3 端为羟基 由具有发夹结构的约70 90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成 特点 具有高度的保守性 时序性和组织特异性 27 28 28 miRNA介导的RNAi miRNA的研究起始于时序调控小RNA stRNAs 1993年 Lee等在秀丽隐杆线虫 Caenorhabditiselegan 中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin 4 2002年 Reinhart等又在线虫C elegan中发现第二个异时性开关基因let 7 2001年10月 science 报道了三个实验室从线虫 果蝇和人体克隆的几十个类似C elegan的lin 4的小RNA基因 称为microRNA 随后多个研究小组在包括人类 果蝇 植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs 对一部分miRNAs的研究分析提示 miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程 包括发育进程 造血过程 器官形成 凋亡 细胞增殖 甚至是肿瘤发生 WhataremicroRNAs 1 miRNA是广泛存在于真核生物中的一组短小的 不编码蛋白质的RNA家族 它们是由19 25个核苷酸 nt 组成的单链RNA 3 端可有1 2个碱基长度的变化 miRNA的表达具有组织特异性和阶段特异性 即 在不同组织中表达有不同类型的miRNA 在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达 编码miRNA的基因可位于基因组的非编码区 以及编码蛋白质基因的内含子 外显子和非翻译区 这些基因在基因组中成簇排列或分散排列 WhataremicroRNAs 2 miRNA具有高度保守性 即各种miRNA都能在其他种系中找到同源体 miRNA独有的特征 其5 端第一个碱基对U有强烈的倾向性 而对G却有抗性 但第二到第四个碱基缺乏U 一般来讲 除第四个碱基外 其他位置碱基通常都缺乏CmiRNA执行一定的生物学功能 对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用 一些偏大的miRNA可能参与了基因组的重组 27nt miRNA的成熟 据体内外实验研究表明miRNA的生成至少需要两个步骤 1 由长的内源性转录本 pri miRNA 生成70nt左右的miRNA前体 pre miRNA 该过程发生在细胞核 2 将pre miRNA加工为成熟miRNA 该过程发生在细胞质中 Structureofpri miRNAs A pri miRNAs的结构 B 人类pri miR 30aRNA的发夹环 Drosha切割位点 箭头 Dicer切割位点 三角 Pre miRNA Pre miRNA是由内源性基因间区或内含子的DNA反向重复序列转录而来 它是一种长约70nt的非编码RNA 具有茎 环结构也即发夹状结构 Pre miRNA在Dicer的作用下可被剪切成miRNAmiRNA只是pre miRNA茎中的一个臂 miRNA的加工 1 Pri miRNA被Drosha切割2 pre miRNA被Dicer切割3 Exportin5 Exp5 将miRNA装运到胞质中 DroshavsDicer 1 RIII RNaseIII催化结构域 D dsRNA结合结构域 PRORICH proline rich结构域 RS RICH arginine serinerich结构域2 Drosha和Dicer都具有RNaseIII和dsRNA结合结构域 MicroRNAs的多样性 1 miRNAs发现的数量近年来快速增长2 2006年10月 miRBase9 0 收录4361个具有发夹结构的前体miRNAs 能够表达出4167个miRNA产物3 Release12 0 收录8619个具有发夹结构的前体miRNAs 能够表达出8273个miRNA产物 MicroRNAs的多样性 拟南芥 187154152人 695 miRNA与靶mRNA的作用模式 1 二者不完全互补 即二者不完全配对结合时 主要影响翻译过程 阻遏翻译 而对mRNA的稳定性无任何影响 这种miRNA是目前发现最多的种类 如线虫的lin 4 2 二者完全互补 即二者完全配对结合后 类似siRNA与靶mRNA的结合 特异性的切割mRNA 如miR39 miR171当miRNAs和编码蛋白质的mRNA几乎完全配对时 miRNAs诱导RNA介导 RNAi 的干扰途径 3 上述两种模式均具备 当其与靶mRNA完全互补配对时 直接靶向切割mRNA 而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用 如let 7果蝇 线虫 miRNA的调控特点 交叉调节 动物miRNA与靶mRNA之间的不完全配对使得任何一 个miRNA都可能作用于不同的mRNA 一个mRNA也可能受到多个不同miRNA的调节 自我调节 自我调节参与了miRNA的生物合成和功能 例如 参与miRNA生物合成的一些酶也受到其产物miRNA的调节 Dcl1mRNA编码一种植物Dicer蛋白参与miRNA的生成 同时它也是miR2162的靶分子 可逆性调节 miRNA所致的翻译抑制在某些条件下是可逆的 当 mRNA作为miRNA抑制的靶分子后 mRNA会被送至胞浆内的P Pbodies 重新定位 miRNA调节方式的优点 与蛋白水平的调节相比 更加节省能量 与转录水平调节相比 miRNA调节更迅速 而且是可逆的 内含子所编码的miRNA是一种对基因组资源的高效利用 microRNA基因组分布 60 独立表达 15 成簇表达 25 的miRNAs位于内含子 植物与动物miRNA的区别 动物 植物 前体茎环结构 短 简单 长 复杂 折回长度变异明显 加工过程作用机制 先在细胞核 后在细胞质仅在细胞核中大部分作为翻译阻遏子 大部分介导靶mRNAs小部分导致靶mRNAs降解的降解 长度保守性 22 23nt高 21nt更高 经典理论 2008Nature 小结 miRNA的作用是多种多样的 它既可以通过关闭一些关键基因来改变细胞的命运 也可能与其靶基因产物相互作用形成调节环并与其他调节通路交织作用形成网络调控机制 大多数miRNA并非独立作用 而是参与到复杂的基因调控网 络中 据推测 人类三分之一的mRNA都被miRNA调控 随着它们的 作用机理逐步明了 相信将会给人类带来更多的福音 由于RNA病毒入侵 转座子转录 基因组中反向重复序列转录等原因 细胞中出现了dsRNA 注 病毒入侵 或者是自身合成RNA中出现错误 细胞内就会产生双链RNA 来阻止这些异常基因的表达 siRNA 在Dicer酶的作用下 这些双链RNA被加工成20 25nt的siRNA 而后这些siRNA被组装进入一种RNA诱导的沉默复合体 RNA inducedsilencingcomplex RISC 由核酸内切酶 核酸外切酶 解旋酶等构成 作用是对靶mRNA进行识别和切割 最后 这些siRNA与靶mRNA分子互补配对 并引导RISC剪切 降解RNA分子 因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA 其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达 所以是一种典型的负调控机制 49 siRNAsiRNA结构 21 23nt的双链结构 序列与靶mRNA有同源性 双链两端各有2个突出非配对的3 碱基 siRNA功能 是RNAi作用的重要组分 是RNAi发生的中介分子 内源性siRNA是细胞能够抵御转座子 转基因和病毒侵略的屏障 49 50 50 siRNA介导的RNAi 51 siRNAi的特点 高效性和浓度依赖性特异性位置效应时间效应细胞间RNAi的可传播性多基因参与及ATP依赖性 51 小干扰RNA smallinterferingRNA siRNA 和微小RNA的异同点 miRNA与siRNA的作用机制 2020年2月19日 54 2020年2月19日 54 二 MicroRNAs在发育中的调控作用 1 lin 4和let 7miRNAs调控线虫发育的时间点 lin 4在幼虫发育过程中的作用 在线虫的幼虫发育期 lin 4下调LIN 14和LIN 28蛋白质的浓度 从而一方面阻止后期发育 一方面促进幼虫的发育 lin 4 不完美的剪辑配对 miRNAgenediscovery 1 Forwardgenetics lin 4 let 72 Reversegenetics miR 181 mir 273 lsy 6和mir 273决定神经细胞的分化 1 Asymmetricchemosensoryneurons 非对称的化学感应神经元 ASEleft ASEL andASEright ASER 感受环境的化学刺激2 ASEL表达gcy 7 ASER表达gcy 5 化学受体 miRNA在脊椎动物发育中的功能 miR 124a和miR 1的功能 1 在Zebrafish Medaka Mouse 和Fly中表达miR 124a和miR 12 miR 124a仅在鱼和鼠的脑以及脊髓中表达 在果蝇的腹神经索中表达3 miR 1仅在小鼠的肌肉和心脏中表达4 miR 124a和miR 1的序列保守性高 miRNA控制植物表型特征 jaw D的突变对TCP基因表达的影响 miRNA调控造血干细胞的分化 1 3种miRNA控制造血干细胞向淋巴细胞的分化过程 miR 181 miR 223 miR 142s2 miR 181 主要在小鼠骨髓的B 淋巴细胞中表达3 miR 223 骨髓原细胞 病毒编码的miRNAs 病毒编码的miRNAs SV40编码的miRNAs 1 降低细胞毒素T淋巴细胞 cytotoxicTlymphocytes 识别裂解的能力2 病毒早期转录肿瘤抗原 Tantigen 3 在转录后期 SVmiRNAs结合早期的肿瘤抗原 并使之降解4 降低肿瘤抗原的浓度 从而降低细胞毒素T淋巴细胞识别的可能性 腺病毒的VA1RNA 1 Adenovirusvirus associated1 VA1 RNA 2 在核里与其它前体miRNA竞争与exportin 5的结合 竞争与Dicer的切割3 干扰免疫应答 宿主miRNAvs病毒基因组 1 宿主miR 32与primatefoamyvirus 灵长类泡沫病毒 type1结合限制其扩增 病毒的Tas能够抑制该过程2 肝特异性的miR 122能够与HCV 丙肝病毒 结合 使其扩增 可能是激活病毒的复制 或者改变其亚定位 三 RNAi与异染色质 Fissionyeast 1 RNAi调控异染色质的沉默与组蛋白H3K9的甲基化 2 在fissionyeast中删除argonaute dicer等基因 破坏RNAi机制 发现动粒附近的异染色质重复片段表达异常的转录本3 由H3K9的甲基化缺失导致转录激活 损伤动粒的功能4 动粒的重复片段 其转录沉默的状态由H3K9的甲基化以及染色质与Swi6结合所决定 RNAi促使异染色质化 1 RNAi的分子机器对动粒重复片段的异染色质化的起始和维持是必须的 1 动粒反链的转录片段被RNAi沉默并降解2 动粒正链转录本低表达 被Rdp1扩增并产生siRNA3 Rdp1与染色质结合 促进siRNA介导的组蛋白修饰 RNAi促使异染色质化 异染色质的形成 1 重复片段相关的siRNA rasiRNA 通路 2 重复片段的双链的相对的启动子转录 形成长链dsRNA3 由Dicer切割成siRNAs4 与RISC结合 引起同源DNA的沉默5 确立沉默的状态 引发DNA甲基化和组蛋白甲基化 并招募异染色质结合蛋白质 RNAi与异染色质 植物 1 dsRNA与染色质沉默密切相关2 植物的转基因被同源dsRNA的表达所沉默 并使同源DNA区域发生甲基化3 由siRNA介导 甲基转移酶能够被招募到靶基因的位点 四 miRNA在癌症发生中的作用 1 人中已发现695个miRNAs 命名为 has miRx2 miRNA在癌症发生中表达谱的变化 检测334个哺乳动物样本中的217个miRNAs的表达情况3 与正常组织相比 miRNAs在肿瘤中的表达显著的下调4 与mRNA相比 miRNA的表达谱是一个很好的癌症分类指标 miRNA调控癌基因的表达 1 c Myc调控的miRNA控制E2F1的表达2 c Myc是一个具有helix loop helix的亮氨酸拉链的转录因子 调控人类和果蝇基因组中约10 15 的基因的表达3 c Myc激活人类13 染色体上成簇的六个miRNAs4 E2F1是一个转录因子 在c Myc的下游 促使细胞周期的发生5 E2F1的表达受到miR 17 5p和miR 20a的负调控 c Myc诱导miRNA的表达 1 Tet tetracycline 四环素 降低c Myc的表达 c Myc诱导miRNA的表达 1 野生型2 c Myc敲除3 Myc c Myc敲除后再转入外源c Myc基因 miRNA 肿瘤抑制因子 1 p53调控miR 34a c的表达2 在DNA损伤以及癌基因压力的情况下 通过依赖于p53的通路中诱导3 在肿瘤及其分化的细胞株中过表达miR 34能够抑制细胞周期的过程 miRNA 可能是致癌基因 1 mir 17 92的基因簇在人类B细胞淋巴瘤中扩增 与正常细胞相比 其表达量明显上调2 mir 17 92的基因簇与c myc协同作用 促进小鼠中B细胞淋巴瘤的生长3 从造血干细胞中分化的肿瘤表达mir 17 92的基因簇的一部分 阻止细胞凋亡 是c myc诱导的淋巴瘤中广泛存在的想象 mir 17 92基因簇 1 46个淋巴瘤样本和47个直肠癌的样本vs 正常组织2 mir 17 92基因簇表达明显的上调 五 siRNA的应用 1 siRNA一般21 23bp 19bp的双链互补区 两边对称的 伸出的序列 5 phosphate P and3 hydroxyl OH 基团 2 正义siRNA的5 端稳定性较高 3 端稳定性较低 切割位点稳定性也较低 siRNA设计的原则 1 mRNA的ATG下游50 100bp 最好 75bp2 效率较高的siRNA设计模体 AAN19TT NAN19NN NARN17YNN NANN17YNN3 50 GC含量 30 70 4 尽量避免三个连续相同的核苷酸 尤其是GGG5 避免序列上已知是mRNA结合蛋白质位点的部分6 使用BLAST搜索核酸数据库 以保证其唯一性 siRNA的设计 1 将外源的siRNA转入细胞中 暂时的表达 化学合成 较贵2 使用T7启动子体外转录前体miRNA体外表达的dsRNA能够被大肠杆菌的RNaseIII或RNaseIII likeDICER所切割在细胞或者动物模型中表达siRNA3 使用polIII启动子表达siRNA siRNA的设计 利用PolIII启动利用启动子表达hairpinRNA shRNA 1 U6或H1的RNAPIII启动子 终止信号TTTTT2 在各种组织中都能够有效地表达shRNA3 a 将互补的hairpinRNA HP 构建到一起 b 分别构建 转录后形成双链 哺乳动物中siRNA载体的构建中siRNA载体的构建 人类细胞中siRNA载体的构建 siRNA的应用 1 产生在长时间内可被观测的表型2 设计在体外或体内稳定的细胞系 在异种移植模型中 检测血管生成 肿瘤细胞迁移的可能性3 快速的在转基因小鼠中建立亚等位基因4 将shRNAs与已知的 高效的基因投递装置结合 形成有效的基于RNAi的治疗方案 RNAi体内合成用各种载体的比较 RNAi激活免疫应答通路 RNAi的应用 总结 1 RNAinterference siRNA miRNA以及RNAi的分子机制2 miRNAs的功能 动物的生长发育等3 miRNA在癌症发生中的作用 biomarker 作用机理4 siRNA的应用 产生siRNA的方法 siRNA在基础研究以及治疗方面的应用