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DB52/T XXX.1-2018贵州省地方标准保健用品安全性评价指导及试验方法第 4 部分 毒理学安全性评价检验（征求意见稿）I目 次前言1 适用范围.12 规范性引用文件.13 术语和定义.14 受试物.15 实验动物及环境要求26 毒理学试验的项目 .27 毒理学试验项目的选择原则28 保健用品安全性评价毒理学试验方法 . 28.1 急性经口毒性验.28.2 多次皮肤刺激性.58.3 急性眼刺激性试验.68.4 皮肤变态反应试验.88.5 体内哺乳动物细胞微核试验108.6 阴道黏膜刺激性试验119 注意事项 13附录 A 13附录 B 15II前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由贵州省卫生标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：贵州省疾病预防控制中心本标准主要起草人：刘佳、刘泳廷、王雨、苑洁、高敏、叶建方、郑冲、刘玲、周桂芳III1DB52/T XXX.1-2018保健用品安全性评价指导及试验方法第 4 部分 毒理学安全性评价检验1、范围本标准规定了具有能改善人体微循环、缓解疼痛、祛湿通络等功效的一类外用保健用品的毒理学安全性评价检验项目。本标准适用于评价直接或间接外用于人体皮肤的贴剂、喷剂和膏剂，还包括（但不限）浴粉或香薰包（香包）等。2、规范性引用文件 1）下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本文件。GB 14925 实验动物 环境及设施 化妆品安全技术规范2015 年版 国家食品药品监督管理局消毒技术规范卫生部 2002 年版3、术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 保健用品直接或间接作用于人体皮肤表面，不以预防和治疗疾病为目的，具有日常保健、促进康复功能的贴剂、膏剂、擦剂、喷剂等产品。但法律、法规对药品、保健食品、医疗器械、特殊用途化妆品、消毒产品、体育器械等另有规定的除外。4、受试物 2毒理学试验所用保健用品样品批号应与卫生学试验（理化、微生物）样品批号一致。5、实验动物及环境要求 5.1 急性经口毒性试验和体内哺乳动物细胞微核试验宜使用纯系小白鼠（大白鼠）进行试验。5.2 皮肤刺激试验、眼刺激试验、粘膜刺激试验宜使用白色家兔进行试验。5.3 皮肤变态反应试验宜使用白色豚鼠进行试验。5.4 实验动物和饲养环境、饮用水、饲料应符合 GB14925 的要求。购进的实验动物至少应在实验动物房环境中适应性喂养 3 天。6、毒理学试验的项目应包括：急性经口毒性试验；皮肤刺激性试验；急性眼刺激性试验；皮肤变态反应试验；体内哺乳动物细胞微核试验；阴道黏膜刺激性试验。7、毒理学试验项目的选择原则7.1 外用部位与眼部接触可能性大的保健用品，除进行急性经口毒性试验和多次皮肤刺激试验，应加做急性眼刺激试验。7.2 外用部位与粘膜接触可能性大的保健用品，除进行急性经口毒性试验和多次皮肤刺激试验，应加做阴道黏膜刺激试验。37.3 长期使用的保健用品，除进行急性经口毒性试验和多次皮肤刺激试验，应增加皮肤变态反应试验和体内哺乳动物细胞微核试验。8、保健用品安全性评价毒理学试验方法8.1 急性经口毒性试验8.1.1 受试物处理8.1.1.1 一般受试物 应据试验的特点和受试物的理化性质选择适合的溶媒（溶剂），将受试物溶解或悬浮于溶媒中，一般使用水或食用植物油，如使用其他溶媒应说明理由。所选用的溶媒本身应不产生毒性作用；与受试物各成分之间不发生化学反应，且保持其稳定性；无特殊刺激性或气味。8.1.1.2 不溶解的粉剂类受试物提取方法应与产品推荐使用说明相同。如产品无特殊推荐方法，可用水提取物进行试验。水提取物可采用以下提取条件进行：温度 80 90 蒸馏水，浸泡时间至少为 30min。8.1.1.3 含乙醇类的受试物 灌胃给予受试物时，乙醇浓度高于体积分数的 15%的受试物，浓缩后应将乙醇浓度调整至 15%。乙醇浓度低于体积分数的 15的受试物，浓缩后应将乙醇恢复至受试物定型产品原来的浓度。8.1.1.4 受试物中辅料处理：受试物如含有不直接参与功效作用的裱背材料（如辅料胶等）载体物质的原因不适合直接以定型产品进行试验时，可以对送检样品适当处理，但处理过程应与原产品的主要生产工艺步骤保持一致。8.1.2 试验过程8.1.2.1 实验动物：应使用小鼠或大鼠，小鼠体重为 18g-22g。也可选用成年大鼠，体重为 180g-220g。动物在实验室中至少应适应 3-5 天，试验开始时每一性别动物的体重差异应控制在20%内。试验前，应禁食过夜，不限制饮水。8.1.2.2 给药方法：用灌胃方法将受试物一次给予动物。若受试物灌胃容量太大，可在 24 小时内分 2-3 次给予，其总剂量作为一日剂量计算。48.1.2.3 给药后 2 小时内密切观察实验动物的中毒表现、死亡数及死亡时间，若动物未出现死亡，每天进行临床观察，观察时间结束后进行大体解剖病理检查，观察时间为 14 天。8.1.3 试验方法8.1.3.1 一次限量法（limit test）如果受试物毒性很低，可采用一次限量法，即用 10 只动物（雌雄各半）一次灌胃 5000mg/kg 体重剂量，14gd 观察期内无动物死亡，则认为 LD50 大于 5000mg/kg 体重，不再进行多个剂量的急性经口毒性试验，如果动物出现死亡则选择其他方法。8.1.3.2 霍恩氏（Horn）法1）预试验根据受试物的性质和已知资料，选用下述方法：一般多采用 100mg/kg 体重，1000mg/kg 体重和10000mg/kg 体重的剂量，各以 2 只3 只动物预试。根据 24h 内死亡情况，估计 LD50 的可能范围，确定正式试验的剂量组。也可简单地直接采用一个剂量，如 215mg/kg 体重，用 5 只动物预试。密切观察 2 小时内动物的中毒表现。如中毒表现严重，估计多数动物可能死亡，即可采用低于 215mg/kg 体重的剂量系列进入正式试验；反之中毒表现较轻，则可采用高于此剂量的剂量系列。2）正式试验a. 动物数：每组 10 只动物，雌雄各半。b. 常用剂量系列1.002.15 10t t=0,1,2,34.64正式试验时，可根上述剂量系列设计 5 个组，即较原来的方法在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组。c. 观察5观察期内记录动物死亡数、死亡时间及中毒表现等，根据每组死亡动物数和所采用的剂量系列，查表求得 LD50（见附录 A）。d.临床观察包括皮肤、被毛、眼、黏膜以及呼吸系统、泌尿生殖系统、消化系统和神经系统等，特别要应观察有无震颤、惊厥、流涎、腹泻、呆滞、嗜睡和昏迷等（见附录 B）。在试验开始和结束时称取并记录动物体重，并且在观察期 14 天内每周至少称取动物体重 1 次。全面观察并记录动物变化发生的时间、程度和持续时间，评估可能的毒作用靶器官。如发现动物处于濒死或表现出严重的疼痛和持续的痛苦状态应处死动物，并记录。e.病理学检查所有的动物包括试验期间死亡、人道处死和试验结束处死的动物应进行大体解剖检查，记录每只动物大体病理学变化，出现大体解剖病理改变时应做病理组织学观察。f.试验结果评价 根据观察期内记录动物死亡数、死亡时间及中毒表现等，根据每组死亡动物数和所采取的剂量系列（见附录 A），求得 LD50。依据表 1，进行毒性分级。 表 1 经口毒性分级LD50(mg/kg 体重) 毒性分级50 高毒51500 中等毒5015000 低毒5000 实际无毒8.2 多次皮肤刺激试验8.2.1 受试物处理68.2.1.1 受试物原则上按使用说明书的要求进行处理，若无特殊要求，根据性状采用不同的处理方式。8.2.1.2 液体和膏体受试物：一般不需要稀释，可直接取 0.5mL(g)涂抹于动物皮肤。8.2.1.3 固体受试物：固体受试物应将其研磨成细粉状，并用水或其他无刺激性溶剂充分湿润，以保证受试物与皮肤有良好的接触，取 0.5g 敷贴于动物皮肤。使用其他溶剂，应考虑到该溶剂对受试物皮肤刺激性的影响。8.2.1.4 贴剂受试物：剪取 2.52.5有效部位敷贴于动物皮肤。8.2.1.5 需稀释后使用的产品，先进行产品原型的皮肤刺激性/腐蚀性试验，如果试验结果显示中度以上的刺激性，可按使用浓度为受试物再进行皮肤刺激性/腐蚀性试验。8.2.1.6 依据化妆品安全技术规范，当受试物为强酸或强碱(pH 值2 或11.5)，可以不再进行皮肤刺激试验。此外，若已知受试物有很强的经皮吸收毒性，经皮 LD50 小于 200mg/kg 体重或在急性经皮毒性试验中受试物剂量为 2000mg/kg 体重仍未出现皮肤刺激性作用，也无需进行皮肤刺激性试验。8.2.2 试验过程8.2.2.1 健康、成年白色家兔 4 只，单笼饲养，不限进食、饮水。8.2.2.2 试验前将白色家兔背部脊柱两侧被毛剪掉，去毛范围各为 3cm3cm，涂抹/敷贴面积2.5 cm2.5cm。8.2.2.3 取受试物涂抹/敷贴在一侧皮肤上，当受试物使用无刺激性溶剂配制时，另一侧涂溶剂作为对照，每天涂抹/敷贴 1 次，连续涂抹/敷贴 14 天。从第二天开始，每天涂抹/敷贴前应剪毛，用水或无刺激性溶剂清除残留受试物。1 小时后观察结果，按表 2 评分，对照区和试验区同样处理。8.2.2.4 结果评价：按下列公式计算每天每只动物平均积分，以表 3 判定皮肤刺激强度。红斑和水肿积分每天每只动物平均积分=受试动物数147表2 皮肤刺激反应评分皮肤反应 积分红斑和焦痂形成无红斑 0轻微红斑(勉强可见) 1明显红斑 2中度-重度红斑 3严重红斑(紫红色)至轻微焦痂形成 4水肿形成无水肿 0轻微水肿(勉强可见) 1轻度水肿(皮肤隆起轮廓清楚) 2中度水肿(皮肤隆起约1mm) 3重度水肿(皮肤隆起超过1mm，范围扩大) 4最高积分 8表3皮肤刺激强度分级积分均值 强度0 100个 4C.血管充血无 0极少 1轻度 2中度 3重度伴血管破裂 4D.水肿无 0极少 1轻度 2中度 3重度 4刺激反应积分=A+B+C+D17表9 阴道黏膜刺激强度分级阴道黏膜刺激指数 阴道黏膜刺激反应强度1 无1-5 极轻5-9 轻度9-12 中度12 重度9.注意事项9.1 出具的毒理学检验报告需详细描述样品前处理、试验过程、试验毒性反应结果等。9.2 膏贴类的保健用品送检时应送两种型式，定型包装产品和去除了不直接参与功效作用的辅料（如胶类）部分的非定型包装产品，前者主要用于哺乳动物体外试验，后者主要用于哺乳动物经口毒性试验。18附 录 A（规范性附录）霍恩氏（Horn）法 LD50值计算（剂量递增法测定 LD50计算用表）A.1 表 A.1 用于每组 5 只动物，其剂量递增公比为 ，意即31010 =21.5，21.5 =46.4，余此类推。此剂量系列排列如下：310 3101.002.15 10t t=0，1，2，34.64霍恩氏（Horn）法 LD50值计算（剂量递增公比为 ）310组 1 组 2 组 3 组 4 剂量 1=0.464 剂量 1=1.00 剂量 1=2.15或 剂量 2=1.00 剂量 2=2.15 剂量 2=4.64组 1 组 3 组 2 组 4 剂量 3=2.15 剂量 3=4.64 剂量 3=10.0剂量 4=4.6410t剂量 4=10.010t剂量 4=21.510tLD50 可信限 LD50 可信限 LD50 可信限0 0 3 5 2.00 1.372.91 4.30 2.956.26 9.26 6.3613.50 0 4 5 1.71 1.262.33 3.69 2.715.01 7.94 5.8410.80 0 5 5 1.47 3.16 6.81 0 1 2 5 2.00 1.233.24 4.30 2.656.98 9.26 5.7015.00 1 3 5 1.71 1.052.78 3.69 2.275.99 7.94 4.8912.90 1 4 5 1.47 0.9512.27 3.16 2.054.88 6.81 4.4110.50 1 5 5 1.26 0.9261.71 2.71 2.003.69 5.84 4.307.940 2 2 5 1.71 1.012.91 3.69 2.176.28 7.94 4.6713.50 2 3 5 1.47 0.8622.50 3.16 1.865.38 6.81 4.0013.5190 2 4 5 1.26 0.7752.05 2.71 1.694.41 5.84 3.609.500 2 5 5 1.08 0.7411.57 2.33 1.603.99 5.01 3.447.300 3 3 5 1.26 0.7402.14 2.71 1.594.62 5.84 3.439.950 3 4 5 1.03 0.6651.75 2.33 1.433.78 5.01 3.088.141 0 3 5 1.96 1.223.14 4.22 2.636.76 9.09 5.6614.61 0 4 5 1.62 1.072.43 3.48 2.315.24 7.50 4.9811.31 0 5 5 1.33 1.051.70 2.87 2.263.65 6.19 4.877.871 1 2 5 1.96 1.063.60 4.22 2.297.75 9.09 4.9416.71 1 3 5 1.62 0.8663.01 3.48 1.876.49 7.50 4.0216.71 1 4 5 1.33 0.7372.41 2.87 1.595.20 6.19 3.4211.21 1 5 5 1.10 0.6611.83 2.37 1.423.95 5.11 3.078.511 2 2 5 1.62 0.8183.19 3.48 1.766.37 7.50 3.8014.81 2 3 5 1.33 0.6582.70 2.87 1.425.82 6.19 3.0512.51 2 4 5 1.10 0.5502.20 2.37 1.194.74 5.11 2.5510.21 3 3 5 1.10 0.5232.32 2.37 1.134.99 5.11 2.4310.82 0 3 5 1.90 1.003.58 4.08 2.167.71 8.80 4.6616.6表 (续)组 1 组 2 组 3 组 4 剂量 1=0.464 剂量 1=1.00 剂量 1=2.15或 剂量 2=1.00 10t 剂量 2=2.15 10t 剂量 2=4.64 10t20组 1 组 3 组 2 组 4 剂量 3=2.15 剂量 3=4.64 剂量 3=10.0剂量 4=4.64 剂量 4=10.0 剂量 4=21.5LD50 可信限 LD50 可信限 LD50 可信限2 0 4 5 1.47 0.8062.67 3.16 1.745.76 6.81 3.7412.42 0 5 5 1.14 0.6741.92 2.45 1.454.13 5.28 3.138.892 1 2 5 1.90 0.8394.29 4.08 1.819.23 8.80 3.8919.92 1 3 5 1.47 0.6163.50 3.16 1.337.53 6.81 2.8616.22 1 4 5 1.14 0.4662.77 2.45 1.005.98 5.28 2.1612.92 2 2 5 1.47 0.5733.76 3.16 1.248.10 6.81 2.6617.42 2 3 5 1.14 0.4063.18 2.45 0.8756.85 6.28 1.8914.80 0 4 4 1.96 1.183.26 4.22 2.537.02 9.09 5.4615.10 0 5 4 1.62 1.272.05 3.48 2.744.42 7.50 5.909.530 1 3 4 1.96 0.9783.92 4.22 2.118.44 9.09 4.5418.20 1 4 4 1.62 0.8932.92 3.48 1.926.30 7.50 4.1413.60 1 5 4 1.33 0.8852.01 2.87 1.914.33 6.19 4.119.330 2 2 4 1.96 0.9304.12 4.22 2.008.88 9.09 4.3119.10 2 3 4 1.62 0.7973.28 3.48 1.727.06 7.50 3.7015.20 2 4 4 1.33 0.7152.49 2.87 1.545.36 6.19 3.3211.50 2 5 4 1.10 0.6861.77 2.37 1.483.80 5.11 3.198.190 3 3 4 1.33 0.6762.63 2.87 1.465.67 6.19 3.1412.20 3 4 4 1.10 0.5992.02 2.37 1.294.36 5.11 2.789.391 0 4 4 1.90 0.9693.71 4.08 2.097.99 8.80 4.5017.21 0 5 4 1.47 1.022.11 3.16 2.204.54 6.81 4.749.781 1 3 4 1.90 0.7574.75 4.08 1.6310.2 8.80 3.5122.0211 1 4 4 1.47 0.6543.30 3.16 1.417.10 6.81 3.0315.31 1 5 4 1.14 0.5812.22 2.45 1.254.79 5.28 2.7010.31 2 2 4 1.90 0.7065.09 4.08 1.5211.0 8.80 3.2823.61 2 3 4 1.47 0.5643.82 3.16 1.218.24 6.81 2.6217.71 2 4 4 1.14 0.4542.85 2.45 0.9776.13 5.28 2.1113.21 3 3 4 1.14 0.4233.05 2.45 0.9126.57 5.28 1.9714.22 0 4 4 1.78 0.6624.78 3.83 1.4310.3 8.25 3.0722.22 0 5 4 1.21 0.5832.52 2.61 1.265.42 5.62 2.7111.72 1 3 4 1.78 0.4556.95 3.83 0.98015.0 8.25 2.1132.32 1 4 4 1.21 0.3274.48 2.61 0.7059.66 5.62 1.5220.82 2 2 4 1.78 0.4107.72 3.83 0.88316.6 8.25 1.9035.82 2 3 4 1.21 0.2665.52 2.61 0.57311.9 5.62 1.2325.60 0 5 3 1.90 1.123.20 4.08 2.426.89 8.80 5.2214.80 1 4 3 1.90 0.7774.63 4.08 1.679.97 8.80 3.6021.5表 (续)组 1 组 2 组 3 组 4 剂量 1=0.464 剂量 1=1.00 剂量 1=2.15或 剂量 2=1.00 剂量 2=2.15 剂量 2=4.64组 1 组 3 组 2 组 4 剂量 3=2.15 剂量 3=4.64 剂量 3=10.0剂量 4=4.6410t剂量 4=10.010t剂量 4=21.510tLD50 可信限 LD50 可信限 LD50 可信限0 1 5 3 1.47 0.8062.67 3.16 1.745.76 6.81 3.7412.4220 2 3 3 1.90 0.6785.30 4.08 1.4611.4 8.80 3.1524.60 2 4 3 1.47 0.6163.50 3.16 1.337.53 6.81 2.8616.20 2 5 3 1.14 0.6022.15 2.45 1.304.62 5.28 2.799.960 3 3 3 1.47 0.5733.76 3.16 1.248.10 6.81 2.6617.40 3 4 3 1.14 0.5032.57 2.45 1.085.54 5.28 2.3311.91 0 5 3 1.78 0.8563.69 3.83 1.857.96 8.25 3.9817.11 1 4 3 1.78 0.4816.58 3.83 1.0414.2 8.25 2.2330.51 1 5 3 1.21 0.4513.25 2.61 0.9727.01 5.62 2.0915.11 2 3 3 1.78 0.3908.11 3.83 0.84017.5 8.25 1.8137.61 2 4 3 1.21 0.3104.74 2.61 0.66810.2 5.62 1.4422.01 3 3 3 1.21 0.2795.26 2.61 0.60211.3 5.62 1.3024.423附录 B （规范性附录）实验动物中毒表现观察项目器官系统 观察及检查项目 中毒后一般表现动作行为体位异常，叫声异常，不安或呆滞，反复抓挠口周，反复梳理，转圈，痉挛，麻痹，震颤，运动失调，甚至倒退行走或自残各种刺激的反应 易兴奋，知觉过敏或缺乏知觉大脑及脊髓反射 减弱或消失中枢神经系统及神经肌肉系统肌肉张力 强直，弛缓瞳孔大小 扩大或缩小植物神经系统分泌 流涎，流泪鼻孔 流液，鼻翼煸动呼吸系统呼吸性质和速率 深缓，过速24心血管系统 心区触诊 心动过缓，心律不齐，心跳过强或过弱腹形 气胀或收缩，腹泻或便秘消化系统粪便硬度和颜色 粪便不成形，黑色或灰色阴道，乳腺 膨胀阴茎 脱垂泌尿生殖系统会阴部 污秽，有分泌物颜色，张力 发红，皱褶，松弛，皮疹血皮肤和被毛完整性 竖毛黏膜 流粘液，充血，出血性紫绀，苍白黏膜口腔 溃疡眼睑 上睑下垂眼球 眼球突出或震颤，结膜充血，角膜混浊眼透明度 混浊直肠或皮肤温度 降低或升高其他一般情况 消瘦
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