离子交换柱层析法分离氨基酸.ppt

离子交换柱层析法分离氨基酸 指导老师 肖靓小老师 田春丽 李洁茜 一 实验目的和要求 1 学习采用离子交换柱层析法分离氨基酸的原理和方法 2 掌握离子交换柱层析法的基本操作技术 包括树脂的装柱加样 洗脱 检查等 二 实验原理 离子交换树脂是具有酸性或碱性的合成聚苯乙烯 苯乙二烯不溶性高分子化合物 各种氨基酸分子的结构不同从而导致pI点不同 各种氨基酸在同一pH时带有不同的电荷 与离子交换树脂的亲和力有差异 因此可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来 达到分离的效果 树脂对离子的亲和力 与水合离子半径 电荷及离子的极化程度有关 水合离子半径愈小 电荷愈高 极化程度愈大 则它的亲和力愈大 其中静电力起主要作用 在ph 5 8的缓冲液中 在阳离子柱中氨基酸洗出的大体顺序为酸性 中性 碱性 本试验所用氨基酸中 Asp 天冬氨酸 是酸性氨基酸 pI 2 97 Lys 赖氨酸 是碱性氨基酸 pI 9 74 茚三酮跟蛋白质或者多肽在加热条件下发生紫色反应 三 实验试剂 1 732阳离子交换树脂2 2mol L盐酸溶液 3 2mol L氢氧化钠溶液 4 标准氨基酸溶液 天冬氨酸2mg mL 赖氨酸均配制成4mg mL的0 1mol L盐酸溶液 5 混合氨基酸溶液 将上述天冬氨酸 赖氨酸各溶液按1 3的比例混合 6 两种檬酸钠 氧氧化钠 盐酸缓冲液 pH5 8 钠离子浓度0 45mol L的缓冲液和钠离子浓度为0 90mol L的缓冲液 取柠檬酸14 25g 氢氢化钠9 3g和浓盐酸5 25mL溶于少量蒸馏水后 定容至500Ml 另一种定容至250mL 冰箱保存 7 显色剂 称取2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中 加蒸馏水至100mL 8 50 乙醇水溶液 离子交换树脂转型示意图 离子交换树脂分离氨基酸原理示意图 四 实验器材 MC99 3自动液相色谱分离层析仪层析管 20cmX1cm 专用试管 50支 水浴锅铝制试管架X2分光光度计玻璃棒移液管洗瓶硅胶管 五 实验步骤 1 树脂的准备 将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成Na 型后洗至中性待用 方法如下 将干的强酸型离子交换树脂用蒸馏水浸过夜或搅拌2小时 使其充分溶胀 倾去细小颗粒 再用4倍体积的2mol L的盐酸浸泡一小时 树脂换为氢型 倾去清液 洗至中性 再用2mol L的氢氧化钠溶液做同样处理 树脂换为钠型 洗至中性待用 2 连接装置梯度混合器 恒流泵 层析管 部分收集器 3 装柱干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水 将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度 一个同学一手手执烧杯 一手用玻璃棒快速在杯口搅动树脂 使树脂缓慢均匀的流入层析管 另一个同学控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度注意 1 装柱过程不可中断 倒树脂要缓慢均匀2 刚开始倒树脂时 水流出速度要控制到很小 同时可以适当多加点水 最后一段加水和放水都要慢 装柱过程中水面一定不能低于树脂 但也不能溢出 倒好的层析管端面平整 无气泡 约18cm高 4 平衡 将层析管与恒流泵联接 从烧杯中吸取pH 5 8钠离子强度为0 45的柠檬酸缓冲液平衡层析柱 流出液达床体积的四倍以上时 用pH试纸测流出的液体的pH 直到和缓冲液的pH一样时 即试管内的pH和缓冲液一样 即可上样 在平衡同时进行调速 调节恒流泵流速 定时收集流出液并测量流出液的体积 根据流出液体积与所需时间计算其流速 反复调整测量直到流速约为1mL min 5 加样 平衡好后 停止加入缓冲溶液 待缓冲溶液弯月面靠近树脂顶端时 关闭下端开口 加入0 5mL左右混合氨基酸溶液 待样品弯月面靠近树脂顶端时 立即用少量浓度为 0 45mol L 的柠檬酸缓冲溶液冲洗层析管内壁数次 再加入缓冲液约3 4厘米左右 加样时应避免冲破树脂表面 且避免将样品全部加在某一局限部位 注意 平衡 加样 洗脱时都不能冲破树脂表面 加样示意图 6 洗脱并收集 将体积均70mL 建议适量多加 离子强度为0 45与0 9的两种缓冲溶液分别加入到梯度混合器的两个烧杯中 其中0 45的加入到直接输出溶液的那个池 如图将层析管与恒流泵 恒流泵与梯度混合器联接 同时开始用部分收集器开始收集洗脱液 1 5ml 管 50 注意 设置首管为1 若有50支管 建议末管号设置为51 7 氨基酸的鉴定 向各管收集液中加1 5mL水合茚三酮显色剂并混匀 加显色剂规则为 前10管都加 以后每隔一管加一次 但当出现显色时 周围几管都加 在沸水浴中准确加热15min后冷却至室温 再在加过显色剂的试管中加1 5mL的50 乙醇溶液 放置10min 以收集液第二管为空白 对加过显色剂和乙醇的试管进行光波吸收测定 测定570nm波长的光吸收值 以光吸收值为纵坐标 以洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线 注意 1 试管太多 建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴 使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多 否则中间的管容易脱出摔裂 水浴锅内水面刚好没过试管架中层即可 水浴完成后用镊子和抹布把试管架拿出来 2 应避免用手直接接触茚三酮 六 思考题 1 为什么要使样品缓慢的进入层析柱的树脂 2 为什么要使用梯度缓冲液来洗脱 为什么0 45的缓冲液加入到A池中 3 三次加入缓冲液的作用分别是什么 平衡 加样 洗脱 4 试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别为4 0 6 0 7 5和9 0的蛋白质混合液的方案 并简述理由 预祝大家实验成功