高中生物选修3基因工程的基本操作程序ppt课件

1 2基因工程的基本操作程序 1 补 原核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点 并与其结合 转录开始后 RNA聚合酶沿DNA分子移动 并以DNA分子的一条链为模板合成RNA 转录完毕后 RNA链释放出来 紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来 2 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶 RNA聚合酶 RNA聚合酶 3 不能转录为信使RNA 不能编码蛋白质 能转录相应的信使RNA 能编码蛋白质 编码区 非编码区 原核细胞的基因结构 有调控遗传信息表达的核苷酸序列 在该序列中 最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点 启动子 4 真核细胞的基因结构 一个典型的真核细胞基因结构示意图 编码区含有能够编码蛋白质的序列 外显子 不能编码蛋白质的插入序列 内含子 真核生物的结构基因是断裂基因 5 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 外显子 能编码蛋白质的序列内含子 不能编码蛋白质的序列 有调控作用的核苷酸序列 包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点 非编码序列 包括非编码区和内含子 6 转录 mRNA前体 成熟mRNA 7 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质 原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗 连续 不连续 编码区 非编码 8 基因工程基本操作的四个步骤 1 目的基因的获取 2 基因表达载体的构建 3 将目的基因导入受体细胞 4 目的基因的检测与鉴定 9 一 目的基因的获取 1 目的基因主要是指 编码蛋白质的结构基因 2 获取目的基因的常用方法有哪些 1 从基因文库中获取 2 利用PCR技术扩增 3 人工合成 请阅读P9第一和二两段 10 一 从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断 导入到受体菌的群体中 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因 称为基因文库 1 基因文库 11 基因组文库与部分基因文库的关系 12 2 基因文库的构建方法 鸟枪法 供体细胞中的DNA 许多DNA片段 运载体 限制酶 与载体连接载入 受体细胞 产生特定性状 导入 目的基因 分离 直接分离法 一 从基因文库中获取目的基因 13 反转录法 以目的基因转录成的信使RNA为模板 反转录成互补的单链DNA 然后在酶的作用下合成双链DNA 从而获得所需的基因 目的基因的mRNA 杂交双链 单链RNA 单链DNA 单链DNA 反转录酶 核酸酶H 2 基因文库的构建方法 DNA聚合酶 双链DNA 目的基因 14 求异思维 你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗 反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链 像其他DNA聚合酶一样 反转录酶也以5 3 方向合成DNA cDNA合成过程是 第一步 反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链 形成RNA DNA杂交分子 第二步 核酸酶H使RNA DNA杂交分子中的RNA链降解 使之变成单链的DNA 第三步 以单链DNA为模板 在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链 形成双链DNA分子 15 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 根据已知蛋白质的氨基酸序列 推测出相应的信使RNA序列 然后按照碱基互补配对原则 推测出它的结构基因的核苷酸序列 再通过化学方法 以单核苷酸为原料合成目的基因 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 2 基因文库的构建方法 16 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点 操作简便广泛使用 工作量大 盲目 分离出来的有时并非一个基因 专一性强 操作过程麻烦 mRNA很不稳定 要求的技术条件较高 专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 思考 为什么要构建基因文库 直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗 17 二 利用PCR技术扩增目的基因 18 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 条件 做启动子 前提条件 原理 方式 以 方式扩增 即 n为扩增循环的次数 结果 选修1P60 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 二 利用PCR技术扩增目的基因 19 b PCR 聚合酶链式反应 技术扩增 由穆里斯等人于1988年发明 并于1993年获得若贝尔化学奖 PCR反应的过程 变性 退火 延伸 多次重复 结果 双链DNA分子数为2n 可获取大量目的基因 20 过程 a DNA变性 90 94 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 退火 复性25 65 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 从引物的5 端 3 端延伸 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 21 二 基因表达载体的构建 寻根问底 将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗 如果这么做 结果会怎样 有人采用总DNA注射法进行遗传转化 即将一个生物中的总DNA提取出来 通过注射或花粉管通道法导入受体植物 没有进行表达载体的构建 这种方法针对性差 完全靠运气 也无法确定什么基因导入了受体植物 不好检测与筛选 同时也无法增强目的基因的表达水平 也不能确定目的基因产物的存在部位 a 使目的基因在受体细胞中稳定遗传的b 使目的基因复制并遗传给下一代c 同时使目的基因能表达和发挥作用 22 1 用一定的 切割质粒 使其出现一个切口 露出 2 用 切断目的基因 使其产生 二 基因表达载体的构建 核心 3 将切下的目的基因片段插入质粒的 处 再加入适量 形成了一个重组DNA分子 重组质粒 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 23 质粒 DNA分子 限制酶处理 一个切口两个黏性末端 两个切口获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 核心 同一种 二 基因表达载体的构建 4 过程 24 5 基因表达载体的组成 复制原点 目的基因 启动子 终止子 标记基因 它们有什么作用 25 三 将目的基因导入受体细胞 转化 方法 将目的基因导入植物细胞 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞 目的基因进入 内 并且在受体细胞内维持 和 的过程 受体细胞 稳定 表达 阅读掌握 P12 13 26 根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理 你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗 若想将一个抗病基因导入单子叶植物 如小麦 从理论上说 你应该如何做 思考 原因 研究证明 主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮 这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成 通常不存在于单子叶植物中 这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因 如果想将一个抗病毒基因转入小麦 也可以用农杆菌 但要注意两点 要选择合适的农杆菌菌株 因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物 要加趋化和诱导的物质 一般为乙酰丁香酮等 目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢 趋化性 和激活农杆菌的Vir区 诱导 的基因 使T DNA转移并插入到染色体DNA上 27 四 目的基因的检测与鉴定 检查是否成功 检测 鉴定 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 方法 方法 方法 DNA分子杂交 分子杂交 注意与上不同之处 抗原抗体杂交 28 29 四 目的基因的检测和鉴定 细菌的检测 将每个受体细胞单独培养形成菌落 检测菌落中是否有目的基因的表达产物 淘汰无表达产物的菌落 保留有表达产物的进一步培养 研究 30 四 目的基因的检测和鉴定 多细胞生物的检测 将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体 检测这些个体是否摄入目的基因 摄入的基因是否表达 是否表现出相应的性状 淘汰无变化的个体 保留有相应变化的个体进一步培养 研究 例 用棉铃饲喂棉铃虫 如虫吃后不出现中毒症状 说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达 如虫吃后中毒死亡 则说明摄入了抗虫基因并得到表达 从个体水平鉴定 31 1 以下说法正确的是 A 所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B 质粒是基因工程中唯一的运载体C 运载体必须具备的条件之一是 具有多个限制酶切点 以便与外源基因连接D 基因控制的性状都能在后代表现出来 C 练习 32 2 有关基因工程的叙述中 错误的是 A DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B 限制性内切酶用于目的基因的获得C 目的基因须由运载体导入受体细胞D 人工合成目的基因不用限制性内切酶 A 练习 33 3 有关基因工程的叙述正确的是 A 限制酶只在获得目的基因时才用B 重组质粒的形成在细胞内完成C 质粒都可作为运载体D 蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 D 练习 34 思考与探究 1 作为基因工程表达载体 只需含有目的基因就可以完成任务吗 为什么 不可以 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用 还需要有其他控制元件 如启动子 终止子和标记基因等 必须构建上述元件的主要理由是 1 生物之间进行基因交流 只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达 2 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子 只将编码序列导入受体生物中无法转录 3 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记 4 为了增强目的基因的表达水平 往往还要增加一些其他调控元件 如增强子等 5 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位 往往要加上可以标识存在部位的基因 如绿色荧光蛋白基因等 35 2 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素 联系前面有关细胞器功能的知识 结合基因工程操作程序的基本思路 思考一下 若要生产人的糖蛋白 可以用大肠杆菌吗 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链 这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的 内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中 大肠杆菌不存在这两种细胞器 因此 在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的 3 珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分 当它的成分异常时 动物有可能患某种疾病 如镰刀形细胞贫血症 假如让你用基因工程的方法 使大肠杆菌生产出鼠的 珠蛋白 想一想 应如何进行设计 1 从小鼠中克隆出 珠蛋白基因的编码序列 cDNA 2 将cDNA前序列接上在大肠杆菌中可以适用的启动子 另外加上抗四环素的基因 构建成一个表达载体 36 3 将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中 然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌肠杆菌 如果表达载体未进入大肠杆菌中 大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉 如果培养基上长出大肠杆菌菌落 则表明 珠蛋白基因已进入其中 4 培养进入了 珠蛋白基因的大肠杆菌 收集菌体 破碎后从中提取 珠蛋白 37 38