蛋白质相互作用ppt课件

蛋白质相互作用 本身具有生物学意义 这样的相互作用在生物体中是起什么作用的发展技术 利用这样的相互作用创造出一些人为的作用 1 研究蛋白质相互作用的目的是发现并明确其相互作用的生物学意义蛋白质相互作用是一种表象 通过表象分析规律 是研究蛋白质相互作用的核心 种瓜得瓜 种豆得豆 是一种表象 反映了遗传这样一种本质现象可研究对象合适的研究方法 2 研究蛋白质相互作用需要微观和宏观的结合 象与象的一部分 3 定量分析是研究蛋白质相互作用的基础 Input 10 20mgtotalproteinsIPsample Immunoprecipitatedfrom1000mgoftotalproteins 4 定量分析是研究蛋白质相互作用的基础 Relativeexposurelevel 5 研究蛋白质相互作用的意义1 蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础 2 基因只是决定蛋白质 而蛋白质才是发挥作用的主体 蛋白质的相互作用是发挥其功能的主要活动 6 生物学效应 稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋白质相互作用的内涵 7 研究蛋白质相互作用是为了研究相应的生物学功能 确定研究目标 寻找相互作用 建立相互作用网络和功能体系 8 从蛋白质相互作用到生物学功能 运用蛋白质直接相互作用 发现相互作用蛋白质 再分析这些作用的生物学意义 容易犯的错误 研究一大堆的蛋白相互作用 却不知道这些相互作用有什么生物学意义 从物学功能到蛋白质相互作用 通过改变生物学现象 分析蛋白质间的遗传相互作用 进一步研究相关蛋白质的相互作用 容易犯的错误 找到了平行变化的不相关蛋白质 9 发现蛋白质相互作用蛋白质 蛋白质直接相互作用遗传功能分析序列与结构比较模拟验证蛋白质相互作用不同方法的交叉验证不同生物体系中验证 10 ProteininteractionAffinity A B AB Kd A B AB Kd dissociationconstant InteractionKdStreptavidin biotinbinding10 14MAntibody antigeninteraction good 10 8 10 10MAntibody antigeninteraction weak 10 6MEnzyme substrate10 6 10 10M 蛋白质 蛋白质直接相互作用 11 蛋白质 蛋白质直接相互作用 Co immunoprecipitationandantigen antibodyinteraction 免疫共沉淀和抗原抗体结合 Affinityinteraction 亲和作用 Yeasttwo hybridandphagedisplay 酵母双杂交和噬菌体展示 SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis 蛋白质组学技术 12 Co immunoprecipitationandantigen antibodyinteraction 免疫共沉淀和抗原抗体结合 Westernblot 变性抗原 主要用于检测蛋白质的存在与否 免疫共沉淀 非变性抗原 用于鉴定不同蛋白质间的相互作用 免疫共沉淀 Ab Pr1 Pr2非特异性结合 Pr1 Ab Pr2抗体筛库 cDNA表达库 抗体结合表达的蛋白质 从而得到基因 已经被质谱和PCR所淘汰 13 Westernblot 1 电转移效率2 PVDF膜的充分浸润3 转移液中有太多的SDS4 膜的损坏5 转移时胶和膜没有完全接触6 抗体的问题7 抗体的浓度太高或太低8 还原性物质的存在9 封闭不充分 14 SDS PAGEacrylamide的浓度蛋白质上样的量相邻泳道的蛋白质量 离子强度和样品体积转移膜 PVDF膜nitrocellulose膜抗体 15 免疫共沉淀免疫共沉淀 Ab Pr1 Pr2非特异性结合 Pr1 Ab Pr2 16 免疫共沉淀 1 2 3 5 4 抗体很差 Westernblot问题Loading比例不对样品太多正确 17 蛋白质 蛋白质直接相互作用 Co immunoprecipitationandantigen antibodyinteraction 免疫共沉淀和抗原抗体结合 Affinityinteraction 亲和作用 Yeasttwo hybridandphagedisplay 酵母双杂交和噬菌体展示 SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis 蛋白质组学技术 18 Affinityinteraction 亲和作用 GSTpulldown 已知蛋白质和GST融合 与细胞或组织的 蛋白质汤 混合 用谷胱甘肽亲和层析分离和已知蛋白质结合的新蛋白质 GSTtag Biotin Avidin结合 Biotin标记已知蛋白质 通过Avidin结合biotin标记的蛋白质 从而得到与biotin标记蛋白结合的新蛋白质 优点是biotin avidin的结合是最牢靠的 缺点是细胞内结合biotin的蛋白质很多 各种不同的tag 许多 19 GSTpulldown GSTFusionProteinPurification 20 GSTpulldown GSTfusionprotein不够纯 用作bait会产生太多的非特异性蛋白质污染 21 GSTpulldown 22 GSTPulldown binding wash elution 23 Biotin Avidin结合 生物界最稳定的结合之一 24 蛋白质 蛋白质直接相互作用 Co immunoprecipitationandantigen antibodyinteraction 免疫共沉淀和抗原抗体结合 Affinityinteraction 亲和作用 Yeasttwo hybridandphagedisplay 酵母双杂交和噬菌体展示 SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis 蛋白质组学技术 25 Yeasttwo hybrid 酵母双杂交 发现新的相互作用蛋白质鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用确定蛋白质间相互作用的功能基团 26 27 发现新的相互作用蛋白质 28 确定蛋白质间相互作用的功能基团 ProteinA AD 3 白兰白白 29 鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用 兰 相互作用白 不相互作用 30 Two Hybrid的优点 是酵母细胞内的invivo相互作用 只需要cDNA 简单 弱的相互作用也能检测到 31 Two Hybrid的缺点 都是融合蛋白 万一融合出新的相互作用 酵母的翻译后修饰不尽相同 尤其是蛋白质的调控性修饰 自身激活报告基因 都基因库的要求比较高 单向1 3是inframe蛋白质毒性 第三者Z插足介导的相互作用 假阳性 32 lacZ Autoactivation 33 Phagedisplay 噬菌体展示 34 Phagedisplay 噬菌体展示 Phagedisplay的最大优点是数量大细胞 108 109细菌 1010Phage 1012 寻找受体的配体7肽 8x1016 35 蛋白质 蛋白质直接相互作用 Co immunoprecipitationandantigen antibodyinteraction 免疫共沉淀和抗原抗体结合 Affinityinteraction 亲和作用 Yeasttwo hybridandphagedisplay 酵母双杂交和噬菌体展示 SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis 蛋白质组学技术 36 SPRisusedtomonitorinteractionsoccurringinabiospecificsurfaceonametallayerbymeasuringchangesinthesoluteconcentrationatthissurfaceasaresultoftheinteractions SurfacePlasmonResonance 37 38 SPR优点 无标记 实时Label freedetectionSRPdoesnotrequireanylabelsorreportergroupstodetectbiomolecularinteractions Itfollowseverystepinamulti stepanalysisprocedure incontrasttolabel basedmethodsthatoftenonlyreportthefinalstep RealtimemeasurementTheprogressofinteractionsisdisplayeddirectly asaplotofresponse whichisdirectlyrelatedtoconcentrationchangesatthesurface againsttime Immediatefeedbackonthestatusofaninteractionspeedsupassaydevelopmentandanalysis Theresultscanbeprocessedfurtheraftertherun forexampletoextractkineticconstantsfortheinteraction 39 蛋白质 蛋白质直接相互作用 Co immunoprecipitationandantigen antibodyinteraction 免疫共沉淀和抗原抗体结合 Affinityinteraction 亲和作用 Yeasttwo hybridandphagedisplay 酵母双杂交和噬菌体展示 SurfacePlasmonResonanceFRETProteomicanalysis 蛋白质组学技术 40 Donor Acceptor 2 10nm Excitationfrequency Emissionfrequency Excitationfrequency Emissionfrequency FluorescenceResonanceEnergyTransfer FRET 41 Donorisexcitedatthemaximumabsorbancewavelength 380nanometers ofthedonor Acceptorsignalisincreasedattheacceptoremissionmaximum 510nanometers 42 WavelengthoftheFluorescentProteins 43 44 45 46 MeasureinteractionsbetweentwoproteinsinvivoVerysensitiveExcellentresolutionHelpfulincharacterizingmajorconformationalchangesinmacromoleculesDeterminetheinteractionqualitativelyandquantitatively AdvantagesofFRET 47 LimitationsofFRET FRETonlyoccurswhenthetwofluorophoresarewithin2 10nmofeachother whichmeansthatthefluorophoresmustbebroughttogetherviaverycloseprotein proteininteractions Requireexpensiveequipment RequirelabelingofproteinsusingfluorophoreorGFPfusion 48 Proteomicanalysis 蛋白质组学技术 有专门的课题加以介绍 49 研究蛋白质相互作用的单分子技术 原子力相互作用 50 遗传功能分析利用功能缺陷和互补来分析不同蛋白质间的相互关系 不是蛋白质直接相互作用的证据 但可以提供进一步研究的目标 51 蛋白质遗传相互作用 geneticinteraction 是功能性相互作用 有A 小量表达 有B 无表达 有C 无表达 A B C B C 52 有A和B 表达增加 有A和C 小量表达 有B和C 无表达 A B C C 53 有A B和C 高表达 在A B和C的蛋白质复合体中 A是和基因调控区结合并有小的转录活性 B可以和A结合促进A的转录活性 C本身不能直接促进A的活性 所以不大可能和A有直接相互作用 但能通过B的介导进一步促进转录 54 蛋白质直接相互作用 从蛋白质物理的相互作用到功能上的相互作用 蛋白质遗传相互作用 从功能上的相互作用到蛋白质物理的相互作用 蛋白质相互作用是物理相互作用和功能相互作用的统一 55 蛋白质直接相互作用 从蛋白质物理的相互作用到功能上的相互作用 蛋白质遗传相互作用 从功能上的相互作用到蛋白质物理的相互作用 蛋白质相互作用是物理相互作用和功能相互作用的统一 56 57 生物学功能的研究 相互作用的生物学功能研究基本上可以归为两类 获得功能或失去功能 生物学问题 技术手段 对问题的认识 58 相互作用与功能 59 60 获得功能 转基因表达 使得原本不表达该蛋白质的细胞表达了蛋白质 从而和已有的蛋白质发生相互作用 细胞有了新的功能 常用的方法有细胞内转基因过表达蛋白质 转基因老鼠 61 失去功能 抑制蛋白质的表达或用dominantnegative突变体 使原有的蛋白质缺失或失活 细胞功能的丧失 常用的方法有 RNA干扰使蛋白质不表达 蛋白质部分功能片断的影响 基因敲除的细胞 基因敲除的老鼠 62 从生物学功能的改变到相互作用蛋白质的发现 功能性筛选 RNAi 基因敲除小鼠 63 一些常规生化技术方法 方法和原理蛋白质等电点计算 对于实验buffer体系pH值有重要作用 蛋白质浓度的测定 定量分析的基础 荧光 ECL和细胞免疫荧光 层析 离子交换 分子筛 亲和层析 反相层析 等 离心 超速离心 电泳 SDS PAGE 非变性电泳 等点聚焦 等 Kit方便了我们的实验 但不能方便我们对原理的认识 64 谢谢 65