细胞融合及其应用ppt课件

第四章细胞融合及其应用 第一节细胞融合概述第二节细胞融合技术应用 Page 1 Page 2 Page 3 Page 4 Page 5 Page 6 Page 7 Page 8 什么是细胞融合 为什么要进行细胞融合 简述细胞融合的研究历史 第一节细胞融合概述 Page 9 一 细胞融合的概念和意义 1 概念细胞融合 cellfusion 又称体细胞杂交 somatichybridization 即在自然条件下或用人工方法 生物的 物理的 化学的 使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞或使之分化再生 形成新物种或新品种的技术 Page 10 克服物种间杂交不亲和或不能受精或胚胎早期败育 为遗传物质广泛重组提供新途径 如 薯番茄 番茄薯 2 意义 Page 11 3 细胞融合的类型 Page 12 Page 13 1978年 德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣告 他用马铃薯与番茄相结合 得到了地上部分结青色果实的 薯番茄 但地下尚未结出马铃薯的块茎 后来 美国堪萨斯州立大学的科学家 把番茄和马铃薯的细胞部分融合在一起 培育出了地上结黄色果实 地下长白色薯块的 番茄薯 据说番茄的产量很高 Page 14 创造细胞质杂种 某些农艺性状如 细胞质雄性不育 除草剂抗性等都是由细胞质控制的 有性杂交中雄配子携带细胞质极少 难以产生细胞质杂种 细胞融合的杂种细胞质能够选择某一亲本的叶绿体 但线粒体可实现双亲重组 Page 15 为遗传学研究提供新的手段 如 核质相互关系 基因作用与定位 肿瘤的发生等 Page 16 Page 17 二 基本原理 细胞融合的基本原理是什么 简述细胞融合的大致过程 Page 18 1 相关概念 合胞体 synkaryon 在细胞融合过程中 开始阶段只来自两个细胞的细胞质先聚集在一起 而细胞核仍保持彼此独立 这种特定阶段的细胞结构称为合胞体 同核体 homokaryon 同核融合细胞 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体 是由同源的原生质体融合产生的 异核体 heterokaryon 异核融合细胞 来自不同基因型的细胞融合形成的杂交细胞为异核体 由非同源的原生质体融合产生的 杂种细胞 体细胞杂种 来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞核内 产生出杂种细胞 由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞 因此又叫做体细胞杂种 Page 19 2 基本原理 细胞质膜的特性细胞膜融合的原理质膜靠近 质膜局部区域紧密粘连 磷脂分子重排 形成细胞桥 胞质融合 细胞核融合 Page 20 3 细胞融合大致过程 植物细胞融合过程 人造小鼠培育过程示意图 Page 21 三 细胞融合方法 细胞融合方法有哪些 试述其原理 Page 22 1 1植物或微生物原生质体的制备1 2动物单个细胞的获得首先获得动物组织 然后经消化液消化获得单细胞 常用消化液 胰蛋白酶适于细胞间质较少的软组织 胶原酶适于消化胶原和细胞间质丰富的纤维组织 癌组织等 1 融合材料 Page 23 2 融合方法 诱导融合的方法种类 离子诱导融合法 化学诱导高钙 高pH法 PEG 聚乙二醇 法 离心振荡物理诱导显微操作电融合生物法仙台病毒法 Page 24 2 1化学法2 1 1离子诱导融合法 常用的盐类离子有硝酸钠 硝酸钾 硝酸钙 氯化钙等 钠离子能中和原生质体表面的负电荷 使凝聚的原生质体得质膜紧密接触 促进细胞融合 1970年 Power用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体进行了融合 1972年 Carlson也用硝酸钠作融合剂 获得第一个烟草种间体细胞杂交植株 该方法异核体形成频率低 0 1 4 Page 25 2 1 2高钙 高pH法 首先用于人和鼠的动物细胞杂交 后来引用在植物原生质体的融合 并利用这种融合方法获得了烟草体细胞杂种 1973年 50mmol L钙离子 pH值10 5 钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性 影响原生质体膜的结合 高pH值能改变质膜的表面电荷 有利于细胞融合 该方法高pH值对原生质体有害 异种融合效率达10 35 高国楠 1974 Page 26 PEG是一种多聚化合物 分子量在200 20000之间 毒性小易操作 用PEG法与高钙 高pH法结合 制备两亲本的原生质体 并至合适密度 105个 ml 将PEG溶液加入 并孵育一段时间 24 或37 10 20分钟 缓缓加入高钙高pH溶液15分钟 洗涤 收集细胞计算融合率 融合促进剂 伴刀豆球蛋白A 二甲基亚砜和链胃蛋白酶等 提高细胞的融合频率 2 1 3PEG 聚乙二醇 法 Page 27 PEG含有醚键而具有负极性 与水 蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团形成氢键 当PEG分子足够长时 可作为邻近原生质体表面之间的分子桥而使之粘连 PEG也能连接Ca2 等阳离子 Ca2 可在一些负极化基团和PEG之间形成桥 因而促进粘连 在洗涤过程中 连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱 引起电荷的紊乱和再分布 从而引起原生质体融合 高Ca2 高pH清洗增加了质膜的流动性 大大提高了融合频率 PEG诱导融合原理 Page 28 Page 29 蟾蜍血细胞融合实验 Page 30 Page 31 Page 32 Page 33 Page 34 Page 35 Page 36 Page 37 Page 38 物理诱导融合包括离心振荡 显微操作和电融合显微操作 显微操作将大熊猫体细胞注入去核兔卵母细胞卵周隙中 2 2物理诱导融合 Page 39 电融合原理 细胞处于不均一的交变电场 细胞极化成为偶极子 排列成串珠状 再施加瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿 从而导致融合 在融合仪控制下的融合小室内进行 各种指标都可精细调节控制 融合效率高 zimmermann1981 融合频率达60 优点 融合效率高 操作简单 重复性强 无毒性 可在显微镜下直接观察细胞融合过程 Page 40 Page 41 Page 42 Page 43 Page 44 仙台病毒 亦称HVJ HemagglutinatingvirusofJap an的缩写 乙型副流感病毒 属副黏液病毒属 RNA病毒 M Kuroya 1953 年 日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起 并使膜产生一些断裂 两个细胞核会通过裂口融合在一起 不耐热 几乎可凝集所有种类的红血球 而且有溶血性 在鸡胚 各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖 2 3生物法 病毒法疱疹病毒 牛痘病毒和副黏液病毒 Page 45 病毒囊膜上有许多刺突 spike 刺突上都是一个单价血细胞凝集素 刺突还有唾液酸苷酶的活性 水解寡糖链上的唾液酸残基 攻击细胞表面 Page 46 仙台病毒 程序 紫外线将病毒灭活 稀释到一定浓度 加入到细胞悬液中 离心 诱导细胞融合 Page 47 优点 融合效率高 适合于各种动物细胞 仙台病毒在鸡胚中大量繁殖 容易培养 缺点 仙台病毒不稳定 制备过程繁琐 易失活 容易对细胞产生干扰 Page 48 Page 49 Page 50 3 1植物细胞融合 植物原生质体融合无种属特异性 融合效率只与外界条件有关 PEG诱导关键是处理时间 过长损伤原生质体 过短不融合 PEG的规格和纯度 分子量多为4000 6000 电融合 与原生质体密度有关 最适密度为2 104 8 104电融合时 加入少量CaCl2 可维持电导率 保护细胞 交变电流强弱 处理时间长短及电脉冲的大小影响融合率 添加促融合剂 可提高融合率 3 影响融合的因素 Page 51 3 2动物细胞融合亲本细胞表面性质影响大 表面覆盖绒毛且不规则的较容易 表面光滑的不易融合 细胞种类不同 融合效果不同 腹水癌细胞易融合 淋巴细胞或血球细胞不易融合 融合时温度和运动状态 仙台病毒诱导腹水癌细胞融合 37度 振荡 需氧量大 缺氧常不融合 需要Ca2 最适浓度为0 1mol L 最适pH值为7 4 7 8 Page 52 Page 53 四 杂种细胞的筛选和鉴定 一 体细胞杂种的遗传特性 1 细胞分裂与染色体丢失如果细胞分裂而核不发生融合 在以后的发育过程中就会有两种结果 一是细胞分裂几次以后即停止生长从而导致死亡 二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失 如果这样就会产生几种情况 A细胞 B细胞质 A细胞 B细胞质和部分染色体或基因 Page 54 2 基因转移与性状表达由于染色体的部分丢失 常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合 其结果是实现了亲本间的基因转移 基因转移通常是在后代中某些性状得以表达 有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状 Page 55 3 体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定 这可能涉及到多方面的因素 如亲缘关系的远近 培养过程中的染色体变异 细胞核 细胞质遗传物质的重组等 Page 56 二 融合细胞的筛选 I 植物细胞筛选方式1 遗传互补筛选法 利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因 纠正另一亲本的缺陷 令杂种细胞表现正常 如 亲本1 叶绿体缺陷型亲本2 光致死型两亲本在光照下一种死亡 另一种呈白色 融合细胞长成植株呈绿色 并能成长 Page 57 2 抗性互补筛选法 利用亲本细胞原生质体对抗生素 除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞 亲本1 对放线菌素D抗性 但在MS培养基上不能超过50个世代 亲本2 对放线菌素D很敏感 但能在MS上生长 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长 而亲本和其它细胞死亡 Page 58 3 利用物理特性筛选法 根据亲本的原生质体大小 颜色 漂浮密度及电泳迁移率 形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞 如 亲本1 异硫氰酸荧光素 FITC 标记亲本2 碱性蕊香红荧光素标记在荧光显微镜下 亲本1为绿色 亲本2为红色 杂种细胞可以区分 Page 59 4 利用生长特性筛选法 利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞 例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长 但其融合细胞可以产生内源激素 在培养基上不需加激素 Page 60 II 动物细胞筛选方式 1 利用抗药性筛选系统 利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞 亲本A 对氨苄青霉素敏感 对卡娜霉素不敏感亲本B 对卡娜霉素敏感 对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长 Page 61 2 营养互补筛选系统 细胞在缺乏一种或几种营养成分时 不能生长繁殖 即营养缺陷型细胞 利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞 亲本A 色氨酸缺陷型亲本B 苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养 而亲本细胞均会死亡 Page 62 3 温度敏感突变型杂种细胞的筛选 一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长 但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长 由此筛选杂种细胞 亲本一 具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长 亲本二 高温敏感突变型 但不能抗卡娜霉素 杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长 Page 63 Page 64 Page 65 Page 66 第二节细胞融合技术应用 一 动物细胞融合和单克隆抗体制备 一 动物细胞融合研究简史 二 动物细胞融合技术主要应用 三 单克隆抗体制备二 植物原生质体融合培育新品种 一 研究简史 二 融合程序三 微生物原生质体融合构建新菌株 Page 67 一 动物细胞融合和单克隆抗体制备 一 动物细胞融合研究简史生物界自发细胞融合 1838年 Muller发现分散性肿瘤细胞能自发融合产生多核细胞 后来人们发现了多种体内细胞合并现象 Page 68 体外培养细胞融合 1958年 日本人冈田发现仙台病毒具有诱发艾氏癌细胞相互融合的效应 1365年 冈田等利用仙台病毒诱导两种不同动物细胞融合 产生第一个种间异核体 1978年 瑞士科学家和美国科学家将人的纤维肉瘤细胞与小鼠的畸胎瘤细胞融合 获得含人体染色体的小鼠 Page 69 人畜细胞融合引发激烈争论 2000年10月 澳大利亚和美国的两家生物公司把人体细胞和猪细胞融合在一起 并向欧洲专利局申请专利 环保人士指责这些科学家是 弗兰肯斯坦式的科学家 创造怪物的人最终受到怪物的伤害 所造出的是令人恐惧的 半人半猪怪物 目前 融合技术已迅速发展到动物间 动植物间及人体细胞和动植物细胞间 狮头 羊身 蛇尾的吐火怪兽 Page 70 二 动物细胞融合技术主要应用1 染色体的基因定位如 将人体细胞与小鼠细胞融合 在杂种细胞系中 优先排斥人染色体 因此 每种细胞系都仅含有一条或若干条特异性的人染色体 通过对这些细胞系生理生化功能分析 就可以断定特定的人染色体的功能 已经证明 仅保留着1号人染色体的人 小鼠杂种细胞系 才能合成人尿苷单磷酸激酶 证实编码这种激酶的人基因定位在1号染色体上 Page 71 将不同人类疾病遗传缺陷的突变细胞融合 产生的杂种细胞由于基因的互补作用 可恢复其正常的表型 应用基因互补分析 断定突变体所涉及的基因数目 分析基因的结构 剖析遗传疾病的病因 杂种细胞测定不互补 缺失同一基因或同一基因产生同样突变 互补 缺失不同基因或同一基因不同部位发生突变 2 遗传疾病的治疗与基因互补分析 Page 72 3 制备单克隆抗体 Page 73 1 什么是单克隆抗体 回顾抗体基础知识抗体的化学本质是什么 抗体由何种细胞产生 用传统的方法如何获得抗体 三 单克隆抗体技术 Page 74 抗体 能够与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白 能产生抗体的细胞是浆细胞 即效应B细胞 Page 75 抗体的传统生产方法 抗原 反复注射动物 血清中分离抗体 该法制备抗体的缺点 产量低 纯度低 且抗体的特异性差 灵敏度低 如何解决这个问题呢 所有抗体混合 Page 76 人们发现 在动物发生免疫反应的过程中 体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体 而每个B细胞只分泌一种化学性质单一 特异性强的抗体 要想获得大量的单一抗体 必须用单个B细胞进行无性繁殖 即克隆 单克隆抗体 单个B细胞克隆产生的化学性质单一 特异性强的抗体 Page 77 提示1 B细胞可以进行无限增殖吗 提示2 我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的 问题 如何大量生产单克隆抗体 请尝试设计一个方案 Page 78 一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体骨髓瘤细胞能无限增殖 杂交瘤细胞 动物细胞培养技术 设计方案 动物细胞融合技术 单克隆抗体 既能产生特异性抗体 又能大量增殖的细胞 1975年科学家米尔斯坦和柯勒的实验 Page 79 BB B瘤 瘤瘤 B 瘤 一选 选择性培养基 只有杂交瘤细胞才能存活 获得产生相应抗体的B细胞 二选 选能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞 体外培养 小鼠腹腔内培养 2 制备单克隆抗体流程 Page 80 1 动物免疫与免疫脾细胞制备 2 骨髓瘤突变缺陷细胞株的培养和选择 3 细胞融合 淋巴细胞杂交瘤的制备 4 杂交瘤细胞的筛选 5 特异性杂交瘤细胞的筛选 6 杂交瘤细胞克隆化培养和冻存 7 McAB的大量制备 8 单克隆抗体的鉴定 3 制备单克隆抗体的基本技术 Page 81 文献解读 Page 82 免疫的目的是产生足够多的能识别目的抗原的B淋巴细胞 1 动物免疫与免疫脾细胞制备 Page 83 文献解读 Page 84 2 骨髓瘤细胞的培养和选择 骨髓瘤细胞 一般不分泌抗体 能在体外无限繁殖和连续继代培养 且为HGPRT 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 或TK 胸腺嘧啶核苷激酶 培养可采用一般的动物细胞培养液 小牛血清的浓度一般在10 20 Page 85 细胞融合前必须做骨髓瘤细胞对HAT选择培养基敏感性实验 不敏感的细胞不能用于细胞融合 什么是HAT选择培养基 HAT选择系统 Page 86 HAT是含一定浓度次黄嘌呤 H 氨基喋呤 A 及胸腺嘧啶核苷 T 的一种选择性培养基 其中三种成分与细胞DNA合成有关 DNA合成途径有两种 HAT选择系统 Page 87 Page 88 B淋巴细胞具有HGPRT TK这两种酶 因此在DNA合成正常途径被阻断后 仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA 可在HAT培养基中存活 但B淋巴细胞是正常细胞 不能长期存活 杂交瘤细胞具有双亲的遗传特性 具有来自于淋巴细胞的HGPRT和TK 可以采用补救途径合成DNA 因此可在HAT培养基中存活与繁殖 Page 89 3 细胞融合 淋巴细胞杂交瘤的制备 PEG法诱导细胞融合流程 将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2 1或10 1的比例混匀于50ml锥形离心管内 1200rpm离心7 10分钟 尽量吸净上清液 用手指轻击管壁 使管底沉淀的细胞铺展成薄层 在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50 的PEG0 5ml 随后静置90秒 再于5分钟内边振摇边逐滴加入5 10ml不含血清的培液或盐水缓冲液 以终止PEG的作用 再静置10分钟 Page 90 4 HAT培养基筛选杂交瘤细胞 悬浮于HAT培养液中培养 每隔3 4天半量更换HAT培养液 15天后改用HT培养基 3周后改用完全RPMI1640培养液 培养8 12天进行抗体检测 Page 91 5 特异性杂交瘤细胞的筛选 通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞 仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞 可取上清液 根据抗原的性质 抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择 可溶性抗原可采用放射免疫 免疫酶标测定 间接血凝等方法测定 细胞抗原可采用免疫荧光 溶血空斑测定等方法直接测定针对这些抗原的抗体 Page 92 6 杂交瘤细胞克隆化培养和冻存 利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系 在培养过程中 一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞 如小鼠的腹腔巨噬细胞 脾细胞或胸腺细胞等 方法有有限稀释法 软琼脂培养法 显微操作法 应用荧光激活分选仪等 阳性杂交瘤细胞应及时冻存 防染色体丢失 变异及污染 Page 93 文献解读 Page 94 文献解读 Page 95 文献解读 Page 96 7 McAB的大量制备 Page 97 文献解读 Page 98 8 单克隆抗体的鉴定 文献解读 Page 99 4 单克隆抗体的应用4 1病毒性疾病的诊断和治疗 可检测多种病毒中非常细微的株间差异 鉴定细菌的种型和亚种 诊断异常准确 误诊率大大降低 例如 抗乙型肝炎病毒表面抗原 HBsAg 的单克隆抗体 灵敏度比当前最佳的抗血清还要高100倍 能检测出抗血清的60 的假阴性 Page 100 4 2癌症治疗可检查出尚无临床表现的极小肿瘤病灶 检测心肌梗死的部位和面积 人们正在研究 生物导弹 单克隆抗体作载体携带药物 使药物准确地到达癌细胞 以避免化疗或放射疗法把正常细胞与癌细胞一同杀死的副作用 在人体扫描图技术和肿瘤定位方面已获得很大进展 Page 101 4 3生产免疫避孕药可精确地检测排卵期 将早期胚胎来制备单克隆抗体 新一代免疫避孕药就是用精子 卵透明带或早期胚胎来制备单克隆抗体 将它们注入妇女体内 人体就会产生对精子的免疫反应 从而起到避孕作用 Page 102 4 4生产生物药品生物药品主要有各种疫苗 菌苗 抗生素 生物活性物质 抗体等 是生物体内代谢的中间产物或分泌物 过去制备疫苗是从动物组织中提取 得到的产量低而且很费时 现在 利用细胞工程或细胞融合途径 大大提高了效率 还能制备出多价菌苗 可同时抵御两种以上的病原菌的侵害 Page 103 4 5免疫学研究鉴定 区分各种抗原检测抗原上的决定簇 对抗体的基因定位及表达进行研究 4 6大分子蛋白的提纯将抗体交联到溴化氢活化的琼脂糖基质上 制成免疫亲和层析柱 提纯得到的蛋白质杂质含量低 对产物起始浓度要求低 Page 104 二 植物原生质体融合培育新品种 1 研究简史1972年美国的Carlson使粉兰烟草与郎氏烟草的细胞融合 获得烟草种间杂种植物 1977年后 中国农业科学院烟草研究所的科研人员 用普通烟草和黄花烟草的体细胞进行融合 培育出两批烟草杂种植株 并开花结实 1978年德国的梅歇尔斯首次将番茄和马铃薯细胞融合成功 称之为 pomoto Page 105 科间体细胞杂交再生植株的仅有几例 胡萝卜 烟草 胡萝卜 水稻 胡萝卜 大麦 其中胡萝卜 烟草获得可育杂种植株 但在以上例证中 双亲或亲本之一属于组织培养较容易的模式植物 烟草或胡萝卜 80年代以来 X或 射线在不对称体细胞杂交中广泛应用 通过照射双亲之一 供体 的细胞 使其染色体消减 以减小双亲的不亲和性 1996年 夏光敏等人首次将紫外线成功地用于小麦的属间体细胞杂交 小麦与新麦草及高冰草属间不对称体细胞杂交的植株再生 Page 106 现在 除了种内与种间能获得杂种植株外 在属间甚至不同科的植物间亦获得了成功 如烟草与大豆 烟草与天仙子 矮牵牛与小花矮牵牛 番茄与矮牵牛 葡萄与柴胡等都得到了杂种植株 Page 107 2 融合程序 制备原生质体诱导融合杂种细胞筛选杂种细胞分化再生植株鉴定 Page 108 1 制备葡萄与柴胡原生质体用葡萄品种 胜利 的花药接种在B528培养基上诱导愈伤组织 取继代后新长出的小颗粒状愈伤组织建立悬浮细胞系 用B528液体培养基每7d转代1次 取继代4 5d的悬浮细胞分离原生质体 酶解时间3 4h 原生质体用0 6mol L甘露醇 5mmol LCaCl2清洗2次 调成1 106 mL的密度 用作融合受体 取狭叶柴胡幼茎茎节诱导并筛选出淡黄色粉粒状愈伤组织 继代6 8d时用于游离原生质体 纯化后的原生质体以1 106 mL密度放入小培养皿中成薄层 经强度为260 W cm2UV分别照射0 1 2和3min后 用作融合供体 例 葡萄与柴胡原生质体融合及培养 Page 109 2 诱导融合 以上受体分别与UV照射不同时间的供体以葡萄 狭叶柴胡 1 1的比例混合均匀 用改良的PEG法诱导融合 分别培养双亲原生质体作对照 融合及对照原生质体用B528附加9 葡萄糖的培养基进行培养 培养物置于25 黑暗中 培养物中再生的小愈伤组织长到1 1 5mm大小时将其转入含2 4 D1mg L的MS培养基上增殖 然后转移到1 2MS 0 5mg L6 BA的培养基上分化 Page 110 19个单细胞克隆再生的愈伤组织转移到分化培养基上 培养5个月后共有11个克隆来源的愈伤组织分化出体细胞胚 幼叶及叶丛 对称融合产生的幼叶及叶丛以后未能生根 它们逐渐变褐 停止生长 培养8 10个月以后 经不对称融合产生的6 7 11和18号克隆再生愈伤组织新分化出根叶完整的小植株 作为对照的葡萄原生质体只能分裂至小细胞团 柴胡原生质体再生愈伤组织没有分化 Page 111 葡萄与柴胡科间体细胞杂交再生杂种植株 a 葡萄 柴胡融合克隆2及再生的叶丛 b d 葡萄 柴胡融合克隆6 7 18再生的小植株 Page 112 3 杂种鉴定 形态比较 对融合再生的愈伤组织及幼叶与亲本在外形 颜色上进行比较 不同融合克隆早期 5个月时 形成的幼叶形态各异 不同于双亲 后期 8 10个月 新分化的植株表形有的介于双亲之间或不同于双亲 图1 b c 有的形态像葡萄 图1 d 未出现与柴胡类似的再生植株 Page 113 图2杂种克隆18再生幼叶 5个月 a 及植株 8个月 b 染色体 示双着丝粒染色体 染色体组型分析 用于融合的葡萄愈伤组织染色体数目87 左右为20 38 柴胡愈伤组织染色体数88 为9 12 20 48 18 28 Page 114 同工酶鉴定 5SrDNA间隔序列多态性分析 图3融合再生愈伤组织及幼叶的酯酶及5SrDNA间隔序列分析 a 杂种愈伤组织1 8号克隆及双亲的同工酶谱 b 杂种克隆7 10 18号再生幼叶及双亲幼叶经25mer 引物PCR扩增的5SrDNA间隔序列图谱 G 葡萄 B 柴胡 M 标准分子量 示双亲特征带 示新带 Page 115 中国科学院上海植物生理生态研究所 植物细胞的空间电融合 项目 Page 116 三 微生物原生质体融合构建新菌株 微生物原生质体融合的应用 获得了性状优良且稳定的菌株 培育新的乳糖发酵菌缩短发酵周期 融合新的曲霉提高酱油酿造的质量 培育具有多种杀虫能力的新菌株 Page 117