酶学ppt课件

第五章酶学 Enzyme 1 第一节酶促反应的特点及酶的分类 2 酶的发现及研究历史 人们对酶的认识起源于生产与生活实践 夏禹时代 人们掌握了酿酒技术 公元前12世纪周朝 人们酿酒 制作饴糖和酱 春秋战国时期已知用麴 曲 治疗消化不良的疾病 酶者 酒母也 3 4 enzyme inyeast enzyme是希腊文en in zyme yeast 5 什么是酶 酶是生物催化剂生物体一切生化反应都需酶催化才能进行 性能远远超过人造催化剂定义 由活细胞产生的 有高度专一性和高效催化作用的生物大分子 6 酶及生物催化剂概念的发展 克隆酶 遗传修饰酶蛋白质工程新酶 蛋白质类 Enzyme 天然酶 生物工程酶 核酸类 Ribozyme Deoxyribozyme 模拟生物催化剂 7 一 酶的催化特性 1 提高反应速度 不改变平衡点 2 只起催化作用 本身不消耗 3 降低反应的活化能 一 与一般催化剂相同的特点 8 活化能 activationenergy 指在一定温度下 1mol底物全部进入活化态所需要的自由能单位 KJ mol 酶催化反应的实质 降低反应的活化能 9 1 易失活 温和性 二 生物催化剂的特点 常温 常压 中性 除个别RNA为催化自身反应的酶外 其余所有的酶都是蛋白质 10 2 高效性 且无副反应 反应速度是无酶催化 普通人造催化剂催化反应速度的106 1016倍 11 12 3 专一性 Specificity 酶对催化的反应和反应物有严格的选择性 底物 Substrate 酶作用的物质 13 1 酶浓度的可调性 2 通过激素调节酶活性 3 反馈抑制调节酶活性 4 抑制剂和激活剂 5 别构调控 共价修饰 同工酶等 4 可调节性 14 指酶对底物的选择性 也称特异性 反应专一性 立体异构专一性 绝对专一性 相对专一性 族专一性 键专一性 旋光异构专一性 几何异构专一性 二 酶的专一性 15 三 酶的命名和分类 一 习惯命名法 根据其催化底物来命名 如淀粉酶 蛋白酶等 根据所催化反应的性质来命名 如脱氢酶 转移酶等 结合上述两个原则来命名 例如丙酮酸脱羧酶等 有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点 16 优点命名简单应用历史较长 使用方便缺点一名数酶 一酶数名为了适应酶学发展的新情况 国际酶学会议于1961年提出一个新的系统命名法及分类原则 已被国际生化协会采用 17 二 国际系统命名法 系统名称包括底物名称 反应性质 最后加一个酶字 18 底物1 底物2 反应性质 酶 乳酸 NAD 丙酮酸 NADH H 乳酸 NAD 氧化还原酶 当底物为水时 可省略 19 系统名 包括所有底物的名称和反应类型 惯用名 只取较重要的底物名称和反应类型 对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型 20 三 国际系统分类编号 1961年国际酶学委员会 EnzymeCommittee EC 根据酶所催化的反应类型和机理 把酶分成6大类 21 22 氧化 还原酶催化氧化 还原反应 催化氢的转移或电子传递 主要包括脱氢酶 dehydrogenase 和氧化酶 Oxidase 如 乳酸 Lactate 脱氢酶催化乳酸的脱氢反应 1 氧化还原酶Oxidoreductase 四 六大类酶的特征 23 1 脱氢酶类 催化直接从底物上脱氢的反应 2 氧化酶类 催化底物脱氢 氧化生成H2O2 催化底物脱氢 氧化生成H2O 3 过氧化物酶 24 4 加氧酶 双加氧酶和单加氧酶 25 转移酶催化基团转移反应 即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上 根据X分类 转移碳基 酮基或醛基 酰基 糖基 烃基 含氮基 含磷基和含硫基的酶 例如 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应 2 转移酶Transferase 26 水解酶催化底物的加水分解反应 主要包括淀粉酶 蛋白酶 核酸酶及脂酶等 例如 脂肪酶 Lipase 催化的脂的水解反应 3 水解酶hydrolase 27 裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应 主要包括醛缩酶 水化酶及脱氨酶等 例如 延胡索酸水合酶催化的反应 4 裂合酶Lyase 28 异构酶催化各种同分异构体的相互转化 即底物分子内基团或原子的重排过程 例如 6 磷酸葡萄糖异构酶催化的反应 5 异构酶Isomerase P P 29 合成酶 又称为连接酶 能够催化C C C O C N以及C S键的形成反应 这类反应必须与ATP分解反应相互偶联 例如 丙酮酸羧化酶催化的反应 丙酮酸 CO2 草酰乙酸 6 合成酶LigaseorSynthetase 30 酶的系统编号 4位数字第一位 代表六大类反应类型第二位 亚类 作用的基团或键的特点 第三位 亚亚类 精确表示底物 产物的性质 第四位 在亚亚类中的序号 31 第二节酶的结构与功能的关系 32 一 酶的化学本质及分类 经酸碱水解终产物是AA 能被蛋白酶水解而失活 酶可变性失活 酶是两性电解质 具有不能通过半透膜等胶体性质 具有蛋白质的化学呈色反应 化学本质是蛋白质 一 酶的化学本质 33 1982年T Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA ribozyme 核酶 以后又陆续发现了真正的RNA催化剂 34 单纯酶 只有蛋白质结合酶 缀合酶 脱辅酶 辅助因子 辅助因子 辅基 辅酶 与酶结合紧 与酶结合松 全酶 二 酶的化学组成 35 羧肽酶 36 37 结合酶中 单独酶蛋白或辅助因子没有催化活性一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合同种辅助因子可与不同的酶蛋白结合 38 酶蛋白 决定反应的专一性辅助因子 传递电子 原子或某些化学基团的作用 39 40 monomericenzyme 一般由一条肽链组成oligomericenzyme 为寡聚蛋白 2个亚基multienzymecomplex 几种酶靠非共价键彼此嵌合而成 由数个独立的酶组合起来形成络合体 催化一系列反应 如糖代谢 脂代谢 三 单体酶 寡聚酶 多酶复合体 根据酶蛋白分子的特点 41 活性中心 activecenter 与酶活力直接相关的区域 局限在酶分子的特定部位 二 酶的活性部位 activesite 42 结合中心 与底物结合决定酶促反应的专一性催化中心 促进底物发生化学变化决定酶促反应的性质 活性中心 43 与酶的催化活性直接相关的化学基团常见 His咪唑基 Ser OH Glu COOH Cys SH Asp OH 位于活性中心 活性中心以外 稳定分子构象 必需基团 非必需基团 一 必需基团 44 底物 活性中心以外的必需基团 结合基团 催化基团 活性中心 45 Asp His Ser 胰凝乳蛋白酶的活性中心 活性中心重要基团 His57 Asp102 Ser195 46 为Tyr248为Arg145为Glu270为底物 Zn 羧肽酶活性中心示意图 47 二 酶活性部位的特点 1 几个残基 辅助因子 单纯 结合 2 在空间构象上集中到一起 单体 寡聚 3 疏水空穴 4 通过次级键与底物结合 6 活性中心构象具有柔韧性和可塑性 5 与底物诱导契合 48 49 三 研究酶活性部位的方法 1 酶分子侧链基团的化学修饰法化合物活性部位AA残基侧链基团 共价结合 水解酶 确定一级结构位置 50 推测某基团是否在活性中心某基团被修饰后 酶活力改变 为必需基团 1 非特异性共价修饰 51 2 特异性共价修饰 试剂专一修饰活性部位某AA 使酶失活 如 二异丙基氟磷酸 DFP 专一修饰ESer OH 仅修饰活性中心Ser OH 52 53 3 亲和标记法 与S结构相似的共价修饰剂能被专一地引入活性部位 接近S结合位点其活泼的化学基团可与活性部位某一基团形成稳定的共价键 54 对甲苯磺酰 L 苯丙氨酸乙酯 TPE 对甲苯磺酰 L 苯丙氨酰氯甲基酮 TPCK 胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶 55 2 动力学参数测定法活性部位AA残基解离状态和酶活性直接相关通过动力学方法求有关参数 对酶活性部位化学性质作出判断 3 X射线晶体结构分析法 56 4 定点诱变法利用定点诱变技术 改变编码蛋白基因中的DNA顺序 改变其中某AA后 测定酶活性的变化 57 四 酶原的激活 酶原 zymogen 酶的无活性的前体酶原的激活 由无活性的酶原转变为有活性的酶的过程 酶原激活的意义 在特定的环境和条件下发挥作用 避免细胞自身消化 有的酶原可以视为酶的储存形式 58 酶原激活的机理 59 60 61 62 63 第三节酶作用的机制 64 诱导契合机制 酶与底物靠近 定向 酶与底物相互诱导变形 契合成中间产物 产物脱离 一 酶催化高效性的机制 酶催化的本质 降低反应的活化能 65 一般催化剂反应活化能 反应总能量变化 酶促反应活化能 非催化反应活化能 初态 终态 能量改变 活化过程 酶促反应降低活化能 过渡态 66 一 底物和酶的邻近效应和定向效应 靠近静电吸引疏水作用 定向 底物 酶 67 二 底物的形变和诱导契合 诱导互补性结构变化 契合 能否契合 专一性的由来 68 产物脱离 酶复原 催化剂 69 羧肽酶A 70 羧肽酶催化中的电子云形变 71 C O 电子云形变 定向极性专一性契合区 H2 N C精氨酸 72 酶活性中心提供H H 受体使敏感键断裂的机制 酸催化 OH NH3 NH COOH SH AH B 碱催化 失电子态 E COO A E COOH E COO H 三 酸碱催化 73 74 碱催化 酸催化 75 稳定活性中心 吸附羧氧原子 使肽键失稳 76 酶活性中心亲电 亲核基团参与S敏感键断裂的机制 亲电基团 带正电荷性质的基团亲核基团 带负电荷性质的基团 四 共价催化 77 OH NH2咪唑基 亲电催化 亲核催化 中间产物不稳定 断裂 形成产物 酶复原 不同酶促反应中的催化因素影响大小不同 78 79 OH的亲核催化 胰凝乳蛋白酶 80 1 需要金属离子的酶 1 金属酶 metalloenzyme 含紧密结合的金属离子 2 金属激活酶 metal activitedenzyme 含松散结合的金属离子 五 金属离子催化 81 2 金属离子的作用A 参与底物反应的定向B 通过价态改变参与电子转移C 通过静电稳定 屏蔽负电荷 82 1 锁钥学说 刚性构象 2 诱导契合学说 3 结构性质互补学说 静电效应 极性相同 4 三点附着学说 立体异构专一性的酶 二 与酶专一性有关的学说 83 锁钥学说 认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的 酶表面具有特定的形状 酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样 84 诱导契合学说 酶表面并没有一种与底物互补的固定形状 而只是由于底物的诱导才形成了互补形状 Koshland 1958 当底物和酶接触时 可诱导酶分子的构象变化 使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置 有利于催化 85 羧肽酶的诱导契合模式 86 结构性质互补学说 结合的专一性 与底物结构和酶活性中心的空间结构相关 二者的结构互补 87 三点结合 的催化理论 酶与底物的结合处至少有三个点 而且只有一种情况是完全结合的形式 只有这种情况下 不对称催化作用才能实现 88 89 第四节酶促反应的动力学 90 3 4酶促反应动力学 酶促反应动力学 kineticsofenzyme catalyzedreactions 是研究酶促反应速度及其影响因素的科学 酶促反应的影响因素主要包括酶的浓度 底物的浓度 pH 温度 抑制剂和激活剂等 酶促反应动力学 91 一 酶浓度的影响 在一定温度和pH下 酶促反应在底物浓度大于100Km时 速度与酶的浓度呈正比 酶浓度对速度的影响机理 酶浓度增加 ES 也增加 而V k3 ES 故反应速度增加 92 二 温度对酶促反应速度的影响 酶促反应与其它化学反应一样 随温度的增加 反应速度加快 化学反应中温度每增加10 反应速度增加的倍数称为温度系数Q10 一般的化学反应的Q10为2 3 而酶促反应的Q10为1 2 在一定范围内 反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度 optimumtemperatureTm 一般动物组织中的酶其最适温度为35 40 植物与微生物中的酶其最适温度为30 60 少数酶可达60 以上 如细菌淀粉水解酶的最适温度90 以上 93 温度对酶促反应速度的影响机理 1 温度影响反应体系中的活化分子数 温度增加 活化分子数增加 反应速度增加 2 温度影响酶的活性 过高的温度使酶变性失活 反应速度下降 最适温度不是酶的特征常数 因为一种酶的最适温度不是一成不变的 它要受到酶的纯度 底物 激活剂 抑制剂 酶反应时间等因素的影响 因此 酶的最适温度与其它反应条件有关 94 95 三 pH对酶促反应速度的影响 大多数酶的活性受pH影响显著 在某一pH下表现最大活力 高于或低于此pH 酶活力显著下降 酶表现最大活力的pH称为酶的最适pH 典型的酶速度 pH曲线是较窄的钟罩型曲线 但有的酶的速度 pH曲线并非一定呈钟罩型 如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度 pH曲线 胃蛋白酶的速度 温度曲线如下图 96 胃蛋白酶和葡萄糖 6 磷酸酶的pH活性曲线 97 98 pH对酶促反应速度的影响机理 1 pH影响酶和底物的解离 酶的活性基团的解离受pH影响 底物有的也能解离 其解离状态也受pH的影响 在某一反应pH下 二者的解离状态最有利于它们的结合 酶促反应表现出最大活力 此pH称为酶的最适pH 当反应pH偏离最适pH时 酶促反应速度显著下降 2 pH影响酶分子的构象 过高或过低pH都会影响酶分子活性中心的构象 或引起酶的变性失活 99 动物体内多数酶的最适pH值接近中性 但也有例外 如胃蛋白酶的最适pH约1 8 肝精氨酸酶最适pH约为9 8 见下表 一些酶的最适pH 100 1903年Henri用蔗糖酶水解蔗糖 研究底物浓度与反应速率的关系 绘制了底物浓度与反应关系的曲线图提出了酶底物中间络合物学说 四 底物浓度对酶反应速率的影响 101 102 当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比 反应为一级反应 103 随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速 反应为混合级反应 104 当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加 达最大速度 反应为零级反应 105 酶催化某一化学反应时 酶首先和底物结合生成中间复合物 然后生成产物 并释放出酶 一 中间络合物学说 106 二 酶促反应的动力学方程式 1 米氏方程的提出 1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式 即米 曼氏方程式 简称米氏方程 Michaelisequation 107 研究前提 单底物 单产物反应 酶促反应速度一般在规定的反应条件下 用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示 反应速度取其初速度 即底物的消耗量很小 一般在5 以内 时的反应速度 底物浓度远远大于酶浓度 S E 108 三个假设 1 E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应 而ES分解为E及P的反应为慢反应 反应速度取决于慢反应即V k3 ES 2 S的总浓度远远大于E的总浓度 因此在反应的初始阶段 S的浓度可认为不变即 S St 3 P 0忽略这步反应 109 S 底物浓度V 不同 S 时的反应速度Vmax 最大反应速度 maximumvelocity s 米氏常数 Michaelisconstant 110 2 米氏方程的发展完善及推导 稳态 当反应进行一段时间以后 系统的复合物ES的浓度 由零逐渐增加到一定数值 在一定时间内 虽然底物浓度和产物浓度不断变化 复合物ES的不断生成和分解 当反应系统中ES生产速率和分解速率相等时 络合物ES的浓度保持不变称为稳态 111 稳态时ES浓度不变反应速度V k3 ES ES的生成速度 消耗速度k1 E S k2 ES k3 ES E的质量平衡方程 E Et ES k4 112 1 稳态下 ES 的生产速率 2 稳态下 ES 的分解速率 3 稳态下 ES 的分解速率和生成速率相等 113 4 由上式推导可得稳态时 ES 5 因酶反应速度与 ES 成正比 6 由于S浓度远大于E 当 S 很高时 所有酶被底物饱和形成ES 即 E ES 反应达最大速率 114 从米氏方程可知 当底物浓度很低时 S Km 此时V Vmax 反应速度达最大速度 底物浓度再增高也不影响反应速度 当底物浓度与Km接近时 S Km 此时V 1 2Vmax 反应速度为最大反应速度的一半 115 3 米氏常数的意义 1 物理意义 Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度 2 Km值愈大 酶与底物的亲和力愈小 Km值愈小 酶与底物亲和力愈大 酶与底物亲和力大 表示不需要很高的底物浓度 便可容易地达到最大反应速度 3 Km值是酶的特征性常数 只与酶的性质 酶所催化的底物和酶促反应条件 如温度 pH 有无抑制剂等 有关 与酶的浓度无关 酶的种类不同 Km值不同 同一种酶与不同底物作用时 Km值也不同 各种酶的Km值范围很广 大致在10 1 10 6M之间 116 4 Km在实际应用中的重要意义 1 鉴定酶 通过测定可以鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段 不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶 2 判断酶的最佳底物 如果一种酶可作用于多个底物 就有几个Km值 其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物 如蔗糖酶既可催化蔗糖水解 Km 28mmol L 也可催化棉子糖水解 Km 350mmol L 两者相比 蔗糖为该酶的天然底物 3 计算一定速度下的底物浓度 如某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的99 则 S 99Km 117 4 了解酶的底物在体内具有的浓度水平 一般地 体内酶的天然底物的 S 体内 Km 如果 S 体内 Km 那么V Vmax 底物浓度失去生理意义 也不符合实际状态 5 判断反应方向或趋势 催化正逆反应的酶 其正逆两向的反应的Km不同 如果正逆反应的底物浓度相当 则反应趋向于Km小对应底物的反应方向 118 1 Lineweaver Burk双倒数作图法 5 Km与V的求取 119 120 蔗糖酶米氏常数 Km 的测定 1 配12支蔗糖底物溶液 浓度分别为0 0 005 0 00625 0 0075 0 00875 0 010 0 0125 0 015 0 02 0 025 0 0375 0 050M 在35 水浴保温 2 加入3U ml已在35 水浴保温的酶溶液 准确作用5分钟 终止反应 3 各吸取0 5ml反应液与3 5 二硝基水杨酸 沸水浴5分钟 冷却后在540nm测定吸光度OD值 4 作图 121 2 Eadie Hofstee作图法 122 v V S Vmax 斜率 Km 123 五 激活剂对酶反应速度的影响 能使酶活性提高的物质 都称为激活剂 activator 其中大部分是离子或简单的有机化合物 如Mg 是多种激酶和合成酶的激活剂 动物唾液中的 淀粉酶则受Cl 的激活 特点 1 酶对激活剂有一定的选择性 一种酶的激活剂对另一种酶来说可能是抑制剂2 有一定的浓度要求 当激活剂的浓度超过一定的范围时 它就成为抑制剂 124 六 抑制剂对反应速度的影响 凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂 inhibitor 使酶变性失活 称为酶的钝化 的因素如强酸 强碱等 不属于抑制剂 125 一 酶的抑制作用 失活作用 使酶Pr变性而引起酶活力丧失 抑制作用 使酶活力下降但不引起变性 抑制剂 能引起抑制作用的物质 126 二 抑制程度的表示方法 V0 Vi 不加入抑制剂时的反应速率 加入抑制剂后的反应速率 以反应速率的变化表示 127 1 相对活力分数 残余活力数 2 相对活力百分数 残余活力百分数 V0 Vi Vi V0 128 3 抑制分数 指被抑制而失去活力的分数 V0 Vi 4 抑制百分数 Vi V0 抑制率 129 依据 能否用透析 超滤等物理方法除去抑制剂 使酶复活 不可逆抑制与可逆抑制 三 抑制作用的分类 130 1 不可逆抑制作用 抑制剂与酶必需基团以牢固的共价键相连很多为剧毒物质重金属 有机磷 有机汞 有机砷 氰化物 青霉素 毒鼠强等 不可逆抑制 131 不可逆抑制剂 非专一性不可逆抑制剂 作用于一 几类基团 专一性不可逆抑制剂 作用于某一种酶的活性部位基团 2 不可逆抑制剂 不可逆抑制 132 1 非专一性不可逆抑制剂 重金属离子Ag Cu2 Hg2 Pb2 Fe3 高浓度时可使酶蛋白变性失活 低浓度时对酶活性产生抑制 通过加入EDTA解除 133 H2N CH COOH CH2 SH H2N CH COOH CH2 S CH2COOH ICH2COOH HI 烷化剂 多为卤素化合物 碘乙酸 134 有机磷化合物 敌百虫 沙林 135 胆碱酯酶OH 136 胆碱乙酰化酶 胆碱酯酶 胆碱 乙酰胆碱 积累导致神经中毒症状 137 如何紧急救治 排毒洗胃 喝鸡蛋清牛奶导泄 利尿血液透析 清除游离状态毒物 解毒药 解磷定 138 解毒 解磷定 PAM 139 有机汞 有机砷化合物 与酶分子中 SH作用 可通过加入过量巯基化合物解除 140 氰化物 硫化物和CO 与酶中金属离子形成稳定的络合物如氰化物与含铁卟啉细胞色素氧化酶结合 青霉素 penicillin 与细菌糖肽转肽酶Ser OH活性 影响细胞壁合成 141 2 可逆性抑制 reversibleinhibition 抑制剂与酶以非共价键结合 在用透析等物理方法除去抑制剂后 酶的活性能恢复 即抑制剂与酶的结合是可逆的 142 1 竞争性抑制 competitiveinhibition 1 含义和反应式 抑制剂I和底物S结构相似 抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用 互相排斥 已结合底物的ES复合体 不能再结合I 同样已结合抑制剂的EI复合体 不能再结合S 143 144 2 特点 抑制剂I与底物S在化学结构上相似 能与底物S竞争酶E分子活性中心的结合基团 例如 丙二酸 苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的结构相似 是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂 145 抑制程度取决于抑制剂与底物的浓度比 ES 和 EI 的相对稳定性 加大底物浓度 可使抑制作用减弱甚至消除 146 3 竞争性抑制剂的动力学方程 E SESE PE IEI k1 k2 k3 由米氏方程得 Km Ki E E t ES EI E S ES E I EI ki 147 解方程 得 ES E t 1 1 Km S I Ki 又因vi k3 ES 代入上式得 Vi 1 S Km I Ki Vmax S 148 竞争性抑制剂双倒数曲线 如下图所示 有竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于纵坐标I Vmax处 但横坐标的截距 因竞争性抑制存在变小 说明该抑制作用 并不影响酶促反应的最大速度Vmax 而使Km值变大 1 vi 1 Km Vmax s 1 Vmax 1 I Ki 149 很多药物都是酶的竞争性抑制剂 例如磺胺药与对氨基苯甲酸具有类似的结构 而对氨基苯甲酸 二氢喋呤及谷氨酸是某些细菌合成二氢叶酸的原料 后者能转变为四氢叶酸 它是细菌合成核酸不可缺少的辅酶 由于磺胺药是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂 进而减少细菌体内四氢叶酸的合成 使核酸合成障碍 导致细菌死亡 抗菌增效剂 甲氧苄氨嘧啶 TMP 能特异地抑制细菌的二氢叶酸还原为四氢叶酸 故能增强磺胺药的作用 150 磺胺药物的抑菌作用 151 2 非竞争性抑制 non competitiveinhibition 1 含义和反应式 抑制剂I和底物S与酶E的结合完全互不相关 既不排斥 也不促进结合 抑制剂I可以和酶E结合生成EI 也可以和ES复合物结合生成ESI 底物S和酶E结合成ES后 仍可与I结合生成ESI 但一旦形成ESI复合物 再不能释放形成产物P 152 153 2 特点 I和S在结构上一般无相似之处 I常与酶分子上结合基团以外的化学基团结合 这种结合并不影响底物和酶的结合 增加底物浓度并不能减少I对酶的抑制 非竞争性抑制剂的双倒数曲线 有非竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于横坐标 1 Km处 但纵坐标的截距 因竞争性抑制存在变大 说明该抑制作用 并不影响酶促反应的Km值 而使Vmax值变小 如下图所示 154 非竞争性抑制 Vi Vmax S 1 I Ki Km S 155 3 反竞争性抑制 1 含义和反应式 反竞争性抑制剂必须在酶结合了底物之后才能与酶与底物的中间产物结合 该抑制剂与单独的酶不结合 156 157 2 特点 反竞争性抑制剂存在下 Km Vmax都变小 1 Vi Km Vmax 1 S 1 Vmax I Ki 1 Vi Vmax S S I Ki 1 Km 158 159 第五节酶的纯化及活力测定 160 3 5酶的分离纯化及活力测定 一 酶的分离提纯 一 酶在细胞中的分布 胞外酶 水解酶类 易收集 不必破碎细胞 缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液 胞内酶 除水解酶类外的其它酶类 需破碎细胞 不同的酶分布部位不同 最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器 然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提 161 二 分离材料 动植物原料或微生物的发酵液 微生物发酵液是用于分离酶的最常用材料 因为微生物种类多 繁殖快 培养时间短 含酶丰富 由微生物发酵产生的酶或其它生物组织中的酶因含有大量的其它物质 所以必须经过分离 提纯 结晶等阶段才可做实际应用 对于某种酶的具体制备方案 应通过了解酶的来源 性质及纯度需要来确定 无固定的方案 162 三 原则 在增加酶得率和纯度的同时 尽可能避免高温 过酸 过碱 剧烈的震荡及其它可能使酶丧失活力的一切操作过程 尽最大可能保存酶的活力 四 分离提纯 1 酶的抽提 将酶溶解出来就称为抽提 胞外酶 固体培养的菌体加水或适当缓冲溶液浸泡过滤即可 液体培养的菌体将发酵液离心分离除去菌体收集离心液即可 胞内酶 先破碎细胞 再用水或适当的缓冲溶液抽提 163 2 酶的纯化 纯化的关键是维持酶的活性 因为随着酶的逐渐提纯 一些天然的可保持酶活力的其它成分逐渐减少 酶的稳定性变差 所以整个纯化过程应维持低温 1 酶的沉淀方法 与蛋白质的沉淀方法相同 常用 盐析法 常用硫酸铵盐析 有分段盐析和一次性盐析两种方法 有机溶剂沉淀法 用乙醇 丙酮等 应低温操作 溶剂少量分批加入 等电点沉淀法 164 2 酶的纯化方法 有吸附层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析等 3 酶的结晶 纯化以后的酶液再次沉淀 仍采用沉淀法 4 酶的保存 一般在 20 以下低温保存 165 二 酶活力的测定 定性鉴定提取物中某一酶是否存在 一般是根据此酶引起的化学反应来判断 如检验在提取物中是否存在淀粉酶 则用提取物与淀粉反应 一段时间以后 用碘 碘化钾与反应液反应 若变蓝 说明提取物无淀粉酶活力 反之 提取物有淀粉酶的活力 酶活力的测定 实际上是酶定量测定的方法 酶制剂因含杂质多易失活等原因 故不能用称重或测量体积来定量 166 一 酶活力的概念 指酶催化特定化学反应的能力 其大小通常用在一定条件下酶催化某一特定化学反应的速度来表示 一定量的酶制剂催化某一化学反应速度快 活力大 反之 活力小 速度表示法常用 dS dt或dP dt 测初速度 多用后者 因为反应初期底物过量 底物的减少量不容易测定 而产物从无到有 易测定 167 二 酶的活力单位 1961年国际生化协会酶学委员会统一规定 酶的国际单位 IU 规定为 在最适反应条件 温度25 下 每分钟内催化1微摩尔 mol 底物转化为产物所需的酶量 或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量 称为1标准单位 测定条件 最佳的反应条件 如最适的T 或25 最适pH S E 初速度下 1972年国际生化协会又推荐一种新单位 即Katal Kat 单位 规定 在最适温度下 每秒钟能催化1摩尔底物转化的酶量定义为1Kat 1Kat 60 106IU 168 169 三 酶的比活力 每单位酶蛋白所含的活力单位数 对固体酶 用活力单位 mg酶蛋白 或活力单位 mg酶蛋白氮来表示 对液体酶 用活力单位 ml酶液来表示 很明显 比活力越大 酶的活力越大 170 五 酶活力的测定方法 1 分光光度法 产物与适当的化学试剂生成有色物质或产物有紫外吸收的能力可采用此法 2 测压法 产物中有气体 测气压增加量 3 滴定法 产物中有酸生成 用碱滴定 4 荧光法 产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂反应生成荧光产物可用此法 5 旋光法 产物中有旋光物质可采用此法 除了以上方法外 还可根据产物的性质采用其它方法 171 第七节酶的多样性 172 一 变构酶与变构调节 一 调节酶 凡能通过构象变化或亚基解聚或亚基修饰等方式来改变酶活性而对代谢起调节作用的酶称为调节酶 变构酶又称为别构酶 指调节物与酶分子的调节部位以非共价键结合后 引起酶的构象的改变 进而改变酶的活性状态 酶的这种调节作用称为变构调节 具有变构调节的酶称变构酶 凡能使酶分子发生别构作用的物质称为变构剂或调节物调节物能使酶活性增加的效应叫正协同效应 该调节物叫正调节物 如底物 调节物能使酶活性降低的效应叫负协同效应 该调节物叫负调节物 173 变构酶多为寡聚酶 含的亚基数一般为偶数 且分子中有催化部位 结合底物 与调节部位 结合变构剂 这两部位可以在不同的亚基上 或者在同一亚基的两个不同部位 174 酶的别构 变构 效应示意图 别构酶的反馈调控机理 175 176 二 变构酶作用特点 1 正协同效应的变构酶其速度 底物浓度曲线呈S形 如大肠杆菌的天冬氨酸转甲酰基酶 ATCase 对底物天冬氨酸的结合表现为正协同效应 2 负协同效应的变构酶其速度 底物浓度曲线为类似双曲线 如3 磷酸甘油醛脱氢酶对NAD 的结合为负协同效应 177 178 3 由于变构酶动力学不符合米 曼氏酶的动力学 所以当反应速度达到最大速度一半时的底物的浓度 不能用Km表示 而代之以K0 5S表示 179 三 生理意义 1 在正协同效应的变构酶的S形曲线中段 底物浓度稍有降低 酶的活性明显下降 多酶体系催化的代谢通路可因此而被关闭 反之 底物浓度稍有升高 则酶活性迅速上升 代谢通路又被打开 因此可以通过细胞内底物浓度的变化来灵敏地控制代谢速度 2 变构抑制剂 负调节物 常是代谢通路的终产物 变构酶常处于代谢通路的入口 通过反馈抑制 可以及早地调节整个代谢通路 减少不必要的底物消耗 180 181 例如葡萄糖的氧化分解可提供能量使AMP ADP转变成ATP 当ATP过多时 通过变构抑制剂ATP抑制磷酸果糖激酶的活性 可限制葡萄糖的分解 而ADP AMP增多时 则可通过变构激活剂AMP ADP激活磷酸果糖激酶的活性促进糖的分解 随时调节ATP ADP的水平 可以维持细胞内能量的正常供应 182 183 二 共价调节酶 1 概念 也称共价修饰酶 通过其它酶对其多肽链某些基团进行可逆共价修饰 使处于活性与非活性的互变状态 从而调节酶活性 共价修饰主要是磷酸化 腺苷酰化 甲基化等 共价调节酶是寡聚酶 且在每个亚基上都含有共价修饰的位点 184 2 特点 共价修饰酶通常有活性与非活性两种形式 两种形式之间转换的正 逆反应是由不同的酶催化产生 如骨骼肌中的糖原磷酸化酶有高活性的磷酸化形式与低活性的脱磷酸化形式两种 从脱磷酸化形式转化成磷酸化形式是由磷酸化酶b激酶催化 反之 则是由磷酸化酶磷酸酶催化 185 反应类型共价修饰被修饰的氨基酸残基 共价修饰反应的例子 磷酸化 腺苷酰化 尿苷酰化 Tyr Ser Thr His Tyr Tyr 甲基化 Glu S 腺苷 Met S 腺苷 同型Cys 186 蛋白质的磷酸化和脱磷酸化 第一类 Ser Thr型第二类 Tyr型 第一类 Ser Thr型第二类 Tyr型第三类 双重底物型 187 188 级联系统调控糖原分解示意图 意义 由于酶的共价修饰反应是酶促反应 只要有少量信号分子 如激素 存在 即可通过加速这种酶促反应 而使大量的另一种酶发生化学修饰 从而获得放大效应 这种调节方式快速 效率极高 肾上腺素或胰高血糖素 1 腺苷酸环化酶 无活性 腺苷酸环化酶 活性 2 ATP cAMP R cAMP 3 蛋白激酶 无活性 蛋白激酶 活性 4 磷酸化酶激酶 无活性 磷酸化酶激酶 活性 5 磷酸化酶b 无活性 磷酸化酶a 活性 6 糖原 6 磷酸葡萄糖 1 磷酸葡萄糖 葡萄糖 血液 极微量 大量 189 三 同工酶 同工酶 isoenzyme 是指催化的化学反应相同 酶蛋白的分子组成形式 理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶 这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织 甚至同一组织或细胞中 如乳酸脱氢酶 lactatedehydrogenase LDH 具有多种分子组成形式 LDH5 M4 LDH4 M3H LDH3 M2H2 LDH2 MH3 LDH1 H4 190 乳酸脱氢酶同工酶形成示意图 多肽 亚基 mRNA 四聚体 结构基因 ab 191 LDH同工酶有组织特异性 LDH1在心肌含量高 而LDH5在肝 骨骼肌含量高 因此 LDH同工酶的相对含量的改变在一定程度上反映了某器官的功能状态 临床上利用这些同工酶在血清中的相对含量的改变作为某脏器病变鉴别诊断的依据 同工酶也是研究代谢调节 分子遗传 生物进化 个体发育 细胞分化和癌变的有力工具 在酶学 生物学 和医学中均占有重要地位 192 不同组织中LDH同工酶的电泳图谱 193 同工酶在各学科中的应用 1 遗传学和分类学 提供了一种精良的判别遗传标志的工具 2 发育学 有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况 以及个体发育和系统发育的关系 3 生物化学和生理学 根据不同器官组织中同工酶的动力学 底物专一性 辅助因子专一性 酶的变构性等性质的差异 从而解释它们代谢功能的差别 4 医学和临床诊断 体内同工酶的变化 可看作机体组织损伤 或遗传缺陷 或肿瘤分化的的分子标志 194 四 固定化酶 将水溶性酶用物理或化学方法处理 固定于高分子支持物 或载体 上而成为不溶于水 但仍有酶活性的一种酶制剂形式 称固定化酶 immobilizedenzyme 共价偶联法 交联法 195 五 核酶 具有催化活性的RNA称为核酶 核酶种类 自催化核酶 自我剪切核酶 自我剪接核酶 分子间催化核酶 196 六 多酶体系和多酶复合体 细胞中的许多酶常常是在一个连续的反应链中起作用 即前一个反应的产物是后一个反应的底物 在完整细胞内的某一代谢过程中 由几个酶形成的反应体系 称为多酶体系 multienzymesystem 如果体系中几种酶彼此有机地组合在一起 精巧地镶嵌成一定的结构 即形成多酶复合体 这种结构即能提高反应途径的效率 又能增强调控的准确性 分散多酶体系与中间物示意图 多酶复合体示意图 197 七酶工程简介 一 化学酶工程 天然酶 固定化酶 化学修饰酶 人工模拟酶 二 生物酶工程 克隆酶 突变酶 新酶 将酶学和工程学相结合 产生了酶工程 enzymeengineering 这样一个新的领域 酶工程主要研究酶的生产 纯化 固定化技术 酶分子结构的修饰和改造以及在工农业 医药卫生和理论研究等方面的应用 198 抗体酶 抗体酶 abzyme 又称催化抗体 catalyticantibody 是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体 它除了具有相应免疫学性质 还类似于酶 能催化某种活化反应 抗体与酶相似 都是蛋白质分子 酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的 但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过度态分子向结合 而抗体则与抗原 基态分子 相结合 利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来诱发抗体 这样产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡分子 从而降低反应的活化能 达到催化反应的目的 这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶 199 抗体酶的研究和应用前景 催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法 也使人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂和底物的相互识别有了进一步认识 目前已经发现具有催化作用的自身抗体在生物体内的存在 其不仅和疾病相关 可能还参与了生物体内的某些或基本的生物学反应 有可能成为抗体酶研究的新热点 充分利用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导 可改造的特点 可望制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病或催化某类具有特殊意义反应的抗体酶 抗体酶的研究无疑会对化学 生物学 医学等领域产生深远影响 200 酶的改造和模拟 酶的改造 功能基团的化学修饰酶酶蛋白侧链的化学修饰酶分子内或间的交联反应酶的模拟 根据酶作用的原理摸拟酶的活性中心和催化机理 用化学方法制备结构较简单 高效 高选择性 稳定性能好的新型催化剂 可以是无机化合物 有机化合物或小肽 201 人工模拟酶 benzyme 环糊精 催化侧链 催化侧链连接到环糊精上 可模拟胰凝乳蛋白酶 202 生物酶工程示意图 酶的蛋白质结构功能 新酶分子蓝图 选择性修饰方案 突变酶 新酶 克隆酶 产品 效用 发展 酶基因 遗传设计 遗传修饰 DNA重组技术 DNA重组技术 203 问答题 1 影响酶促反应的因素有哪些 它们是如何影响的 2 试比较酶的竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用的异同 3 什么是米氏方程 米氏常数Km的意义是什么 试求酶反应速度达到最大反应速度的99 时 所需求的底物浓度 用Km表示 4 什麽是同工酶 为什麽可以用电泳法对同工酶进行分离 同工酶在科学研究和实践中有何应用 5 举例说明酶的结构和功能之间的相互关系 6 称取25毫克某蛋白酶制剂配成25毫升溶液 取出1毫升该酶液以酪蛋白为底物 用Folin 酚比色法测定酶活力 得知每小时产生1500微克酪氨酸 另取2毫升酶液 用凯式定氮法测得蛋白氮为0 2毫克 若以每分钟产生1微克酪氨酸的酶量为一个活力单位计算 根据以上数据 求出 1 1毫升酶液中含有的蛋白质和酶活力单位数 2 该酶制剂的比活力 3 1克酶制剂的总蛋白含量和酶活力单位数 名词解释活性中心全酶酶原活力单位比活力米氏方程Km诱导契合变构效应ribozyme辅酶和辅基固定化酶 204