豆芽中氟喹诺酮和硝基咪唑类药物的测定液相色谱-质谱质谱法

ICS67.120.30B 50T/ZACA团体标准T/ZACA XXXXXXXXX豆芽中氟喹诺酮和硝基咪唑类药物残留量测定液相色谱-质谱/质谱法Determinationof residues of fluoroquinolones and nitroimidazoles in beansprout-Liquid chromatography-tandem mass spectrometryXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施浙江省质量合格评定协会发布T/ZACA XXXXXXXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13原理14试剂和材料15仪器26试样的制备与保存27分析步骤28精密度、灵敏度和准确度5附录A（资料性附录）氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物中英文名称、CAS号、分子式和相对分子质量6附录B（资料性附录）氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物混合标准溶液选择离子流图(20g/kg)7前言本标准依据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由浙江省质量合格评定协会提出。本标准由浙江省质量合格评定协会归口。本标准主要起草单位：绿城农科检测技术有限公司、浙江省疾病预防控制中心。本标准参与起草单位：浙江省农业科学院农产品质量标准研究所、湖州市农畜水产品检测中心、丽水蓝城农科检测技术有限公司。本标准主要起草人：余鹏飞、何晓明、章舒祺/徐小民、杨鲁琼、洪琳、倪娟桢、田佩琪、徐杰、沈东强、朱萌萌、周婷婷、卢军、陈志民、朱丽婷。本标准为首次发布。9豆芽中氟喹诺酮和硝基咪唑类药物的测定液相色谱-质谱/质谱法1 范围本标准规定了豆芽中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、洛美沙星、甲硝唑、二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑含量的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于豆芽中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、洛美沙星、甲硝唑、二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑含量的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 原理试样用1%乙酸乙腈提取，经均质提取、浓缩、正己烷净化、离心后，用液相色谱-串联质谱仪测定，用基质外标法定量。4 试剂和材料除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。4.1 试剂4.1.1 乙腈：色谱纯。4.1.2 乙腈：分析纯。4.1.3 乙酸：分析纯。4.1.4 氯化钠：分析纯。4.1.5 甲醇：色谱纯。4.1.6 甲酸：色谱纯。4.1.7 甲酸铵：色谱纯。4.1.8 正己烷：色谱纯4.2 试剂配制4.2.1 1%乙酸乙腈：移取5 mL乙酸（4.1.3）和495 mL乙腈（4.1.2）混合。4.2.2 复溶液（0.1%甲酸30%甲醇水溶液）：300 mL甲醇（4.1.5）、1mL甲酸和699mL水混合。4.3 标准品氟喹诺酮类8种、4种硝基咪唑类标准物质：纯度均大于等于90%（详见附录A）4.4 标准溶液配制4.4.1 标准储备溶液标准储备液：准确称取适量每种氟喹诺酮和硝基咪唑类标准物质（4.3）于25.00mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混合均匀，转移至储液瓶中，-18以下避光保存，有效期为6个月。4.4.2 标准中间液标准中间液：分别准确移取每种标准储备液（4.4.1）于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10.0mg/mL的标准中间液，混合均匀，转移至储液瓶中，-18以下避光保存，有效期为3个月。4.4.3 混合标准工作液分别准确移取每种1.00 mL标准中间液（4.4.2）于10.00mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1.00mg/mL混合均匀，转移至储液瓶中，4以下避光保存，有效期为7天。4.4.4 标准工作曲线移取一定体积的混合标准工作液（4.4.3）用空白基质液分别配制成含4.00g/L、20.0g/L、50.0g/L、100g/L、250g/L、500 g/L的8种氟喹诺酮类和4种硝基咪唑类标准工作溶液，浓度由低到高进样检测，以定量子离子的峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标，采用直线拟合的方式绘制标准工作曲线。实际检测中，经验证后可适当调整标准曲线的浓度范围。5 仪器5.1 液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾（ESI）离子源。5.2 高速组织捣碎机。5.3 分析天平，感量0.01g和0.00001g.5.4 氮吹仪。5.5 涡旋混匀器（2500 r/min）。5.6 离心机：转速12000 r/min。5.7 超声清洗仪。5.8 10mL试管。5.9 离心管：50 mL。5.10 容量瓶：25 mL。5.11 尼龙膜:0.22 m。6 试样的制备与保存取代表性豆芽样品约500 g，将其切碎后（不可用水洗），经高速组织捣碎机均匀捣碎，均分成两份，装入洁净容器内，密封，-18以下保存。7 分析步骤7.1 样品处理称取5 g（精确至0.01g）试样，于50 mL离心管中，加入5mL水和10mL1%乙酸乙腈（4.2.1）均质1 min，超声提取20min，加入5g氯化钠（4.1.4）涡旋1min，12000 r/min离心3min，上层有机相转移到25 mL容量瓶中。残渣再用10 mL1%乙酸乙腈（4.2.1）重复提取一次，合并两次提取液，用1%乙酸乙腈（4.2.1）定容到25mL，混合均匀，准确移取10mL提取液于10mL试管中，40氮吹至近干。加入1mL复溶液（4.2.2），超声3min、涡旋3min，溶解残渣，再加入1 mL正己烷，涡旋30s，12000 r/min离心3min，取下层清液过0.22 m尼龙膜于样品瓶中，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.2 测定7.2.1 液相色谱条件7.2.1.1 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，2.1100mm（i.d.），1.8 m，或性能相当者。7.2.1.2 进样量：5L。7.2.1.3 流速为：0.35mL/min。7.2.1.4 柱温：357.2.1.5 流动相：A为0.1%甲酸2 mmol甲酸铵水溶液；B为0.1%甲酸乙腈。梯度洗脱条件见表1。表1 梯度洗脱程序时间/min流速/（mL/min）流动相A/（%）流动相B/（%）0.000.359370.500.359373.000.3575254.500.355955.000.355955.010.359377.000.359377.3 质谱条件7.3.1 离子源为电喷雾离子源（ESI）。7.3.2 扫描方式为正离子扫描。7.3.3 检测方式为多反应监测。7.3.4 干燥气流量：8.0L/min。7.3.5 加热气流量：10L/min。7.3.6 接口温度：300。7.3.7 雾化气流量：2.8L/min。7.3.8 DL管温度：250。7.3.9 加热块温度：400。7.3.10 毛细管电压：4000V。7.3.11 定性离子对、定量离子对、碰撞能量（CE）和偏转电压（Q1、Q3）见表2。表2 多反应监测条件被测物名称参考保留时间/min母离子（m/z）子离子（m/z）Q1电压/VCEQ3电压/V恩诺沙星4.36360.20316.20*-13.0-19.0-15.0342.20-13.0-21.0-16.0诺氟沙星4.02320.20302.15*-12.0-20.0-22.0231.05-12.0-38.0-25.0培氟沙星4.08334.20316.15*-26.0-21.0-22.0290.15-26.0-18.0-14.0环丙沙星4.10332.20314.15*-23.0-20.0-23.0231.10-23.0-37.0-25.0氧氟沙星4.05362.20318.20*-14.0-19.0-21.0261.15-14.0-27.0-13.0沙拉沙星4.48386.20368.05*-14.0-23.0-26.0342.10-14.0-19.0-24.0洛美沙星4.26352.20265.10*-27.0-23.0-12.0308.20-27.0-16.0-21.0达氟沙星4.26358.20340.15*-30.0-30.0-30.082.10-30.0-50.0-29.0甲硝唑2.94172.10128.10*-22.0-13.0-24.082.15-22.0-25.0-29.0二甲硝咪唑3.46142.1096.15*-10.0-17.0-18.081.15-10.0-25.0-30.0洛硝哒唑3.31201.10140.10*-14.0-14.0-14.055.20-14.0-23.0-24.0异丙硝唑4.80170.10109.15*-21.0-25.0-22.0124.20-21.0-21.0-23.0注： 带“*”的离子为定量离子；对于不同质谱仪，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。7.4 液相色谱-串联质谱测定7.4.1 定量测定采用基质加标单点法或者基质标准工作曲线法定量。根据试样中被测组分的含量，选取响应值适宜的标准工作液进行分析。标准工作溶液和待测样液中8种氟喹诺酮和4种硝基咪唑的响应均在方法的线性响应范围内。如果含量超过标准曲线范围，可调整取样量、定容体积，重新处理样品后进行测定。在上述色谱条件下，参考保留时间参见表2；标准溶液多反应监测色谱图见附录B中B.1。7.4.2 定性测定在相同的实验条件下，样液中被测物的色谱峰保留时间与标准溶液色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在2.5%之内；并且在扣除背景后的样液图谱中，所选的离子对均出现，各定性离子的相对丰度与标准品离子的相对丰度相比，偏差不超过表3规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%5020至5010至2010允许的相对偏差/%202530507.4.3 空白试验除不加试样外，均按上述测定步骤进行。7.4.4 结果计算和表述试样中被测组分含量按式（1）计算，计算结果保留三位有效数字。X=CV1000m10001025 （1）式中：X试样中被测组分的含量，单位为微克每千克（mg/kg）；c标准曲线计算出的试样上机液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V试样的定容体积，单位为毫升（mL）;m试样的质量，单位为克（g）。8 精密度、灵敏度和准确度8.1 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。8.2 灵敏度本方法定量限为2.0 g/kg。8.3 准确度本方法中被测组分的添加浓度在2.00mg/kg250mg/kg时，回收率为70.0%120%。AA附录A （资料性附录）氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物中英文名称、CAS号、分子式和相对分子质量表A.1 氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物中英文名称、CAS号、分子式和相对分子质量序号中文名称英文名称CAS号分子式相对分子质量1恩诺沙星Enrofloxacin93106-60-6C19H22FN3O3359.42诺氟沙星Norfloxacin70458-96-7C16H18FN3O3319.33培氟沙星二水甲磺酸盐Pefloxacin mesylate70458-95-6C18H24FN3O6S429.54环丙沙星Ciprofloxacin85721-33-1C17H18FN3O3331.35洛美沙星Lomefloxacin98079-51-7C17H20ClF2N3O3387.86氧氟沙星Ofloxacin82419-36-1C18H20FN3O4361.47盐酸沙拉沙星Sarafloxacin Hydrochloride91296-87-6C20H18ClF2N3O3421.88甲磺酸达氟沙星Danofloxacin Mesylate119478-55-6C20H24FN3O6S453.59甲硝唑metronidazole443-48-1C6H9N3O3171.210二甲硝咪唑Dimetridazol551-92-8C5H7N3O2141.111异丙硝唑Ipronidazole14885-29-1C7H11N3O2169.212洛硝哒唑Ronidazole.7681-76-7C6H8N4O4200.1BB附录B （资料性附录）氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物混合标准溶液选择离子流图(20 g/kg)表B.1氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物混合标准溶液选择离子流图(20 g/kg)a) 甲硝唑b）二甲硝咪唑c)异丙硝唑d）洛硝哒唑e）诺氟沙星f）氧氟沙星g）培氟沙星h）环丙沙星i）洛美沙星j）沙拉沙星k）达氟沙星l）恩诺沙星_