重组DNA技术相关概念.ppt

DNA克隆 应用酶学的方法 在体外将各种来源的遗传物质 同源的或异源的 原核的或真核的 天然的或人工的DNA 与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子 复制子 replicon 继而通过转化或转染宿主细胞 筛选出含有目的基因的转化子细胞 再进行扩增提取获得大量同一DNA分子 也称基因克隆或重组DNA recombinantDNA 一 重组DNA技术相关概念 基因工程 geneticengineering 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程 又称重组DNA工艺学 二 工具酶 限制性核酸内切酶DNA聚合酶 逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶 三 目的基因 targetgene cDNA complementaryDNA 指经反转录合成的 与RNA 通常指mRNA或病毒RNA 互补的单链DNA 以单链cDNA为模板 经聚合反应可合成双链cDNA 基因组DNA genomicDNA 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息 染色体及线粒体 的所有DNA序列 二 重组DNA技术基本原理及操作步骤 基本原理目的基因的提取克隆载体的选择和构建外源基因与载体的连接DNA导入受体细胞重组体的筛选克隆基因的表达 以质粒为载体的DNA克隆过程 一 目的基因的获取 化学合成法要求 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 基因组DNA文库 genomicDNAlibrary cDNA文库 cDNAlibrary 聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 组织或细胞染色体DNA 基因片断 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 克隆载体 受体菌 基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 从cDNA文库获取目的基因 感受态细胞 competentcell 在自然条件下 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内 但在人工构建的质粒载体中 一般缺乏此种转移所必需的mob基因 因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移 如需将质粒载体转移进受体细菌 需将对数生长期的细菌 受体细胞 经理化方法处理后 细胞膜的通透性发生暂时性改变 成为能允许外源DNA分子进入的细胞 称为感受态细胞 如大肠杆菌经CaCl2处理 就成为容易受质粒DNA转化的细胞 受体菌条件 安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态 competent 导入方式 转化 transformation 转染 transfection 感染 infection 四 重组DNA导入受体菌 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小结