发酵工程总结.doc

.1 绪论1-1何谓发酵？生物化学和工业上的发酵有何不同？生物化学意义上的发酵是指细胞在无氧条件下，分解葡萄糖或有机物产生能量的过程。工业意义上的发酵是泛指利用培养细胞（包括动物、植物和微生物）获得产物的任何有氧或无氧的过程。1-2何谓发酵工程？其主要内容是什么？请简述其与生物技术的关系。发酵工程是利用生物体为工业化生产服务的一门工程技术，即利用生物体的生命活动产生的酶，对无机或有机原料进行酶加工（生物反应过程），获得产品的工程化技术。它是研究生物技术产业化的一门学科，其主体包括生物反应工程和产品提取、精制的下游工程。主要研究内容：1）优良菌种的选育； 2）合适的生物反应工程包括生物反应过程的优化、反应器的选择和下游工程生物技术是应用自然科学和工程学的原理，依靠生物催化剂（酶或细胞）的作用将物料进行加工以提供产品或为社会服务的技术。它包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、生化工程等五大工程。生物技术的核心是基因工程，但又离不开发酵工程。发酵工程是基因工程和酶工程的表达，即大部分生物工程的产品均要通过发酵工程来完成。所以说，发酵工程在生物工程中是最关键的过程。现代发酵工程处于生物技术的中心地位，绝大多数生物技术的目标都是通过发酵工程来实现的。因此生物技术的主要应用领域往往就是发酵工程的 研究对象。1-3请简述发酵工程的发展史。1）基因工程出现之前的时代（1982年前）；1859年发现发酵原理、设计了便于灭菌的密闭式发酵罐；1929,1940年发现和分离出青霉素，青霉素发酵、将通气搅拌引入发酵工业；1956年谷氨酸等氨基酸、核苷酸等发酵成功、代谢控制育种理论的建立；60年代采用烷烃、乙酸、天然气等为原料的石油发酵；2）基因工程出现后的时代（1982年后）。80 年代随着基因工程技术的发展，人们可定向选育高产菌株；1991年综述代谢工程，在对细胞内代谢网络系统分析的基础上开始运用基因工程技术改造细胞代谢途径，以改进细胞性能或提高产物生产能力。组学的发展系统工程和合成生物学1-4 何谓初级代谢和次生代谢？举例说明初级代谢产物和次生代谢产物 。初级代谢：微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动的物质和能量的过程称为初级代谢。常见的初级代谢产物有：乙醇、氨基酸、呈味核苷酸、有机酸、多羟基化合物、多糖（黄原胶、结冷胶）、糖类和维生素。次生代谢：是相对于初级代谢而言的一个概念。它是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动无必要功能的物质的过程。次生代谢产物大都是分子结构复杂的化合物。根据其作用，可将其分为抗生素、激素、生物碱、酶和毒素。3 灭菌3-1 灭菌的方法有哪几种？化学药剂灭菌（过氧乙酸、次氯酸钠、二氧化氯、甲醛、过氧乙酸、环氧乙烷）射线灭菌（紫外线、高能电磁波、放射性物质产生的高能粒子）干热灭菌（160C，1h；主要由于氧化作用而死亡：微波加热灭菌、烘箱加热灭菌）湿热灭菌（120C，30min；利用饱和蒸汽灭菌）过滤除菌（空气除菌、料液的过滤除菌）3-2 何谓空消和实消？各自操作如何？空消：培养基采用连续灭菌时，发酵罐需在培养基灭菌前直接通蒸汽进行空罐灭菌（进汽关阀升压保压30min降压后通入无菌空气冷却）；实消：实罐灭菌，即分批灭菌，将配制好的培养基放在发酵罐或其它装置中，通入蒸汽将培养基和所用装置一起进行灭菌。3-3 连续灭菌流程有哪几种？各自的特点是什么？连消塔喷淋冷却连续灭菌流程：由连消泵、连消塔、维持罐和喷淋冷却器组成薄板换热器连续灭菌流程：由3个薄板换热器、维持管组成，节约了蒸汽和冷却水喷射加热连续灭菌流程：由喷射加热器、维持管、膨胀阀和真空冷却器组成3-4 简述发酵用无菌空气的质量标准。1.连续提供一定流量的压缩空气 ，VVM=0.1-2.0 ；2.空气的压力一般为0.2-0.4 Mpa;3.进入过滤器前空气的相对湿度70% ；4.进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10-30C;5.过滤后空气的无菌程度为10 -3。3-5 空气过滤除菌流程一般包括哪几部分？各自的作用是什么？粗过滤器【去除大颗粒尘埃，粗过滤器分为布袋过滤器、油浴洗涤和水雾除尘器3种】空气压缩机【供给能量】贮罐【缓冲排气压力，稳定气压】油水分离器【去除压缩空气中的大颗粒油水雾】空气冷却器【冷却压缩空气，使其析出水汽】水分离器【分离压缩空气的水汽】加热器【除水后相对湿度一般为100%，加热以降至50-60%】总过滤器【除菌，给全厂提供无菌空气】分过滤器【进一步除菌，保证各发酵罐空气无菌】3-6 某生物制药厂采用空气冷却流程一制备无菌空气，当地空气相对湿度60%。空气进入总过滤器时的状态是：相对湿度60%、压力0.4MPa，温度35C。通过计算确定，当地气温最高不能高于多少？（10、12、15、20、35C的饱和水蒸汽压力分别为1228、1418、1705、2339、5615Pa）P1=0.1MPa，P2=0.4MPa，1= 2 ，4Pb1=Pb2 ，根据饱和蒸气压数据，得t 12C3-7 深层过滤除菌的机理是什么？请简述其各自的作用机制。深层过滤介质的孔隙大于微生物。利用颗粒的惯性冲击、布朗运动、颗粒与介质的静电引力、重力沉降等作用将细菌拦截在介质中进行除菌。一般认为惯性、拦截和布朗运动的作用较大，而重力和静电引力的作用较小。惯性冲击作用：当灰尘颗粒随气流前进遇到过滤介质时，气流受阻而改变方向，而颗粒因惯性作用仍沿直线向前运动，与纤维碰撞摩擦而吸附在纤维表面，以此拦截颗粒。拦截滞留作用：在空气流速较小时，微粒的流动与空气流线相似，受纤维所阻时，改变方向，绕过纤维前进，并在纤维的周边形成一层边界滞流区。而滞流区的空气流速更慢，进到滞流区的微粒慢慢靠近和接触纤维，从而被粘附滞留。布朗运动：在很小气速和较小的纤维间隙时，则布朗扩散作用大大增加了微粒与纤维的接触机会，从而将微粒截留住。重力沉降作用：重力沉降作用是一个稳定的分离作用。当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就很容易沉降。大颗粒比小颗粒更易沉降；对小颗粒来说，只有气速很慢时才起作用。一般它与拦截作用相配合，即在纤维的边界滞流区内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留的捕集效率。静电作用：干空气与非导体的物质（如过滤介质纤维）间的相对运动摩擦，会产生诱导电荷。悬浮在空气中的微生物微粒大多带有不同的电荷，如枯草杆菌孢子20 % 带正电荷，15 % 带负电荷。这些带电的微粒就会受异性电荷的物体吸引而沉降。3-8 空气过滤除菌的设备主要有哪些？各自的作用是什么？粗过滤器【去除大颗粒尘埃，粗过滤器分为布袋过滤器、油浴洗涤和水雾除尘器3种】空气压缩机【供给能量】贮罐【缓冲排气压力，稳定气压】油水分离器【去除压缩空气中的大颗粒油水雾】空气冷却器【冷却压缩空气，使其析出水汽】水分离器【分离压缩空气的水汽】加热器【除水后相对湿度一般为100%，加热以降至50-60%】总过滤器【除菌，给全厂提供无菌空气】分过滤器【进一步除菌，保证各发酵罐空气无菌】4 发酵技术4-1 发酵培养技术有哪些？各种技术的特点是什么？分批发酵、补料分批发酵、半连续发酵、连续发酵分批发酵：发酵液体积恒定，发酵液中物质浓度随时间而变化；分批补料发酵：在分批发酵过程中，间隙或连续的补加新鲜培养基的培养技术。由于只有料液的输入，没有输出，因此，发酵液的体积在不断增加；半连续发酵：补料分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液（行业中称为带放）；连续发酵：补料的同时放走发酵液，发酵液体积不变。4-2 请简述分批培养过程微生物细胞的典型生长曲线及其每个阶段的特点 。停滞期：刚接种后的一段时间内，因菌种对新的生长环境有一适应过程，细胞数目和菌量不变的过程加速期：通常很短，比生长速率可在短时间内从最小升到最大值。对数期：细胞已完全适应其周围环境后，便进入恒定的对数或指数生长期。减速期：随着养分的减少，有害代谢物的积累，生长不可能再无限制地继续。这时虽然细胞量仍旧在增加，但其比生长速率不断下降，细胞在代谢与形态方面逐渐蜕化。平衡期：实际上是一种生长和死亡的动态平衡，【比生长速率】 =【比死亡速率】，净生长速率等于零。由于此时菌体的次级代谢十分活跃，许多次级代谢产物在此时大量合成，菌的形态也发生较大的变化（如菌体分化，染色变浅，形成空胞等）。死亡期：当养分耗竭，对生长有害代谢物在发酵液中大量积累便进入死亡期。这时，生长呈负增长。工业发酵一般不会等到菌体开始自溶时才结束培养。发酵周期的长短不仅取决于前面五期的长短还取决于X0（初始浓度）。4-3 简述微生物产物合成与细胞生长之间的关系及其工艺控制策略 。生长耦联型：微生物的生长、碳水化合物的降解代谢和产物的形成几乎是平行进行的，营养期和分化期彼此不分开，也即代谢产物的生成和细胞的生长是同步的和完全耦联的【策略：延长发酵周期有利于产物合成】；非生长耦联型：产物一般不是直接或间接来自微生物的产能降解代谢，而是通过两用代谢途径合成的，所以产物的生产与细胞生长无直接关系【策略：如次生代谢产物，则以缩短菌体的对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长生产期，以提高产量】；混合生长耦联型：产物间接的与微生物的初级产能代谢途径相关，这类反应产物的生产与细胞的生长仅有间接关系【策略：根据其耦联程度而灵活调节】。4-4 名词解释：比生长速率：指单位菌体（每克菌体）单位时间内（一小时）增加的菌体量基质比消耗速率：指每克菌体在一小时内消耗营养物质的量，它表示细胞对营养物质利用的速率或效率。产物比生成速率：指每克菌体在一个小时内合成产物的量，它表示细胞合成产物的速度或能力。对基质的细胞得率系数【YG】：指每消耗1g（或mol）基质所产生的菌体重。对基质的产物得率系数【YP】：指每消耗1g（或mol）基质所合成的产物质量。基质消耗速率方程：。X是当前菌浓度，m是细菌维持生命活动的消耗系数Luedeking-Piret方程：基本形式为，是描述产物形成动力学中混合生长耦联型的模型。5 发酵工艺5-1 培养基的种类有哪些？前体、促进剂和抑制剂有何不同？何谓碳分解代谢物阻遏、快速利用氮源、生理酸性和碱性氮源？培养基按纯度分为合成培养基【成分完全已知】和复合培养基【一些成分不完全明确】；按状态分固体培养基、半固体培养基、液体培养基；按用途分孢子培养基【繁殖孢子用】、种子培养基【培育种子（用于生产的初始菌）用】、发酵培养基【生产用】。前体是指加入后能直接在生物合成中结合到产物分子中而其自身的结构并没有多大变化，但产物的产量却有较大提高的物质【如VB12的氯化钴】。促进剂是指既不是营养物又不是前体但能提高产量的物质【如促进分散的表面活性剂】。抑制剂是指在发酵过程中加入某些物质会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而使所需产物或正常代谢的中间产物得以积累【甘油发酵中添加亚硫酸氢钠】。碳分解代谢物阻遏是指微生物在混合碳源发酵时优先利用速效碳源（通常为葡萄糖），且该碳源的代谢产物会抑制其它非速效碳源代谢相关的基因表达和蛋白活性，从而影响非速效碳源利用的现象。快速利用氮源即无机氮源，包括氨水、硝酸盐、铵盐。无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性氮源，代谢后产生碱性物质的无机氮源（NO3-）称为生理碱性氮源5-2 最适pH与微生物生长和产物形成的相互关系有哪几种？如何确定某一微生物发酵的生长和产物形成的最佳pH？又如何控制其pH？最适pH与微生物生长和产物形成的相互关系有：、QP都有一个相同的较宽的最适pH范围； (或QP)的最适pH范围一个很窄、一个很宽；和QP对pH都很敏感，但最适pH又相同；和QP对pH都很敏感，但最适pH却不相同。【：菌体生长；QP：产物合成】菌体生长和产物合成的最适pH 根据实验来确定 。发酵过程pH的控制方法 ：1）流加酸：HCl；2）补加氨水或尿素：3）碳酸钙：中和产生CO24）补料控制pH5-3 何谓呼吸强度、耗氧速率、临界溶氧浓度？呼吸强度：表示微生物的相对需氧量，指单位重量干菌体在单位时间内消耗的氧量；耗氧速率：是指单位体积培养液在单位时间内细胞摄取（或消耗）氧的量，也称摄氧速率；临界溶氧浓度：各种细胞对溶解氧浓度有一个最低要求，即发酵过程不需要使溶氧浓度达到或接近饱和值，只是超过此一氧浓度即可。此时溶氧浓度就称为“临界溶氧浓度”。5-4氧传递速率方程是什么？氧传递阻力主要是什么？影响氧传递的因素有哪些？请简述搅拌与通风影响溶氧的的机制。请举出几种氧载体。主要传递阻力是气液相间氧传递过程；影响氧传递的因素有溶氧系数(KLa)和传递推动力(C*-CL )；搅拌能够显著提高溶氧系数，具体表现为：1)搅拌能把大的空气气泡打成微小气泡，a和气液的接触时间增大；2)搅拌使液体作涡流运动，延长了气泡的运动路线，即增加了气液的接触时间；3)搅拌使发酵液呈湍流运动，从而减少气泡周围液膜的厚度，减少液膜阻力；4)搅拌使菌体分散，避免结团，有利于固液传递中的接触面积的增加，使推动力均一。氧载体包括：液态烷烃、正十二烷、正十六烷、全氟化碳、油酸、硅油、豆油。5-5 发酵过程中泡沫是如何形成的？如何控制泡沫？常用的消泡剂有哪些？请具体写出几个代表性消泡剂。在微生物深层培养过程中由于通气和搅拌、代谢气体的逸出以及培养基中糖、蛋白质、代谢物等稳定泡沫的表面活性物质的存在，使发酵液中产生一定数量的泡沫。控制泡沫有两种方法：机械消泡：在搅拌轴上方安装消沫浆，泡沫借旋风离心场而消泡。化学消泡：利用消泡剂以降低液膜的机械强度或降低液膜的表面粘度进行消泡。6 生物反应器6-1 何谓生物反应器？一个良好的生物反应器应具备什么条件？生物反应器指提供适宜细胞生长和产物形成的各种条件，促进细胞的新陈代谢，在低消耗下获得高产量的一种反应设备。一个优良的生物反应器应具备的条件：1)结构简单；2)不易染菌；3)良好的液体混合性能；4)较高的传质传热速率；5)单位时间单位体积的生产能力高；6)同时还应具有配套而又可靠的检测和控制仪表。6-2 常见的通风发酵罐有哪些？分别描述它们各自的结构特征及优缺点。1.通用式发酵罐【既有机械搅拌装置，又有压缩空气分布装置】技术成熟，通用性好，性能稳定；结构复杂，能耗大，造价高2.机械搅拌式自吸式发酵罐【利用机械搅拌的高速旋转而吸入空气】省去了压缩机；吸程短，易染菌，剪切损伤大3.气升式发酵罐【是指利用空气的提升作用而使发酵液循环，没有机械搅拌】结构简单，造价低，避免染菌，能耗低，供氧好，无搅拌剪切；不适宜高粘度或固含量大的发酵4.喷射自吸式发酵罐【利用喷射吸气装置吸入空气而进行气液混合】三相混合与分散良好，溶氧速率高，能耗低，无需提供压缩空气；较易染菌6-3 通用式发酵罐与气升式发酵罐有何区别？两者的主要区别在于：1)气升罐功率消耗比通用式罐低；2)总功率相同时，气升罐的氧传递速率比通用式罐高；3)气升罐比通用式罐结构简单，且没有机械轴封；4)气升罐对细胞的剪切作用比通用式罐要小得多。6-4 厌氧菌培养的特点是什么？酒精发酵罐为什么没有机械搅拌装置？厌氧菌的氧化与有机物的还原耦合，因而形成较少的ATP，其细胞得率比需氧菌少许多。酒精发酵罐属于厌氧发酵罐，发酵过程不需要供氧，且产生的CO2气体可以起到类似气升式罐一般的混合效果，因此没有机械搅拌装置。6-5 什么是固体发酵？其有何优缺点？请简述影响固体发酵的因素。几种固体发酵罐有何共同特点？所谓固体发酵是指，在湿含量低于90% 或不含或很少自由水的固体或含固体颗粒培养基中的发酵。优点：产率高；抗污染强；装料系数大；部分微生物生长更好；可以以加工业残渣为原料，降低生产成本；提取产物所需的溶剂少；发酵废物的处理简单，可直接干燥作为动物饲料。缺点：物料搅拌难，混合不均，控制不易；传热性质差，温度控制难；发酵参数难以检测；不太适合细菌生长；研究不透彻，目前往往依靠经验。影响固体发酵的因素主要有合适菌株的筛选、最适基质的确定和控制参数的优化。共同特点是都严格控制了固体发酵中氧的传递、温度和基质的湿含量。7 基因工程菌的培养7-1 影响工程菌不稳定的因素有哪些？培养基的组成：质粒在丰富培养基比在低限培养基中更加不稳定。合成培养基往往有利于宿主细胞的生长，但不利于外源基因的表达；培养温度：通常低温有利于重组质粒的稳定遗传；菌体的比生长速率：如果宿主菌的比生长速率比工程菌的大，质粒将严重丢失；控制基因的过量表达：外源基因表达水平越高，重组质粒就越不稳定。7-2 何谓高密度培养？重组大肠杆菌的高密度培养的关键和核心是什么？其培养技术有哪几种？高密度培养是指提高菌体的发酵密度，最终提高产物的比生产率（单位体积单位时间内产物的产量）的一种培养技术，通常指分批补料发酵技术。关键是补料策略，即根据工程菌的生长特点及产物的表达方式采取合理的营养流加方案，合理流加碳源降低葡萄糖效应常见的流加技术：恒速流加、变速流加、指数流加、反馈流加。7-3 请简述毕赤酵母作为外源蛋白表达系统的原理。何谓“三段法”？重组毕赤酵母高密度培养时应注意哪些问题？毕赤酵母为甲醇利用型酵母，能以甲醇为唯一碳源和能源生长。甲醇利用途径的第一个酶为醇氧化酶（AOX）。生长在限量甲醇中的细胞能诱导出大量该酶，而生长在甘油、葡萄糖或乙醇中的细胞却不能产生该酶。因此，可利用醇氧化酶基因（AOX1）作为强启动子来构建表达系统而高效表达外源蛋白。三段法：第一阶段，在甘油或葡萄糖为碳源的合成培养基中进行工程菌的分批培养，以积累菌体细胞；第二阶段，在限制生长速率下流加甘油或葡萄糖的流加补料培养，以进一步提高菌体量；第三阶段，即诱导阶段，开始较低速度流加甲醇，以诱导外源蛋白的表达。【该工艺的主要优点是：1）提高细胞存活力；2）缩短诱导时间；3）提高重组蛋白的生产速率。但是过量甘油的流加，又将抑制甲醇利用途径，导致外源蛋白的表达水平降低】重组毕赤酵母的大规模培养的高密度培养时要注意控制代谢副产物乙醇的量，同时还要注意控制甲醇的流加量，它们都将抑制细胞的生长，后者还将影响表达水平。8 动植物细胞的大规模培养8-1 动植物细胞与微生物细胞的区别是什么？8-2 动物细胞的培养方法有哪些？8-3 何谓灌注培养和微载体培养？动物细胞在微载体表面的生长机制是什么？灌注培养：指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断地加入反应器内，另一方面又将培养液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于不断的营养状态中。【细胞密度高，利用时间长，浪费少，避免代谢总产物和有毒代谢副产物的抑制作用】微载体培养技术就是将动物细胞吸附在微载体表面而进行的一种悬浮培养技术。【微载体是指直径在60250m，能适用于贴壁细胞生长的微珠。微载体一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成】锚地依赖性细胞在微载体表面上的增殖，要经历粘附和贴壁、生长、扩展成单层三个阶段。粘附和贴壁：经过数小时的低速搅拌增加细胞与微载体的接触，细胞通过静电作用和范德华力贴附在微载体上。生长：选择最适的生长条件可使生长迅速。扩展成单层：与微载体表面有关。微载体表面光滑时细胞扩展快，表面多孔则扩展慢。8-4 微生物、动植物细胞培养用的机械搅拌通风发酵罐的主要区别是什么？动植物细胞发酵罐中将通用式发酵罐中对细胞剪切损伤较大的搅拌器和通气装置改为对细胞损伤较小的。搅拌轴中空通气，预先将气液混合，并通过笼网消泡，再将无泡的有氧气混合的培养液供入发酵罐。【虽然深层通气，但不产生气泡，细胞不与气泡接触，避免了气泡损伤；搅拌剪切力小，混合性能良好】【进行气液交换的液体量有限，导致溶氧系数小；结构复杂，难以放大，易产生死角，不宜长期连续使用】动植物细胞发酵培养其实也适宜用大气泡的气升式发酵罐，无剪切损伤，气泡损伤小9 发酵动力学研究内容细胞生长和死亡动力学；基质消耗动力学；氧消耗动力学；CO2生成动力学；产物合成和降解动力学；代谢热生成动力学。9-1 名词解释：细胞得率系数、产物得率系数、理论得率系数、比生长速率、比生成速率、比消耗速率、维持系数。细胞得率系数：产物得率系数：理论得率系数：在所有所消耗基质都用于生产产物而不用于细胞生长的情况下，生成产物量和消耗基质量的比值。比生长速率：指单位时间内（1h）单位质量的菌体（1g）所增加的菌体量。比生成速率：指每克菌体在一个小时内合成产物的量。维持系数：每克菌体在一小时内维持其最基本的代谢所需消耗的培养基量。9-2 常见细胞生长动力学和产物形成模型有哪几种？细胞生长动力学：Monod方程，Haldane方程，Logistic方程产物形成模型：Luedeking-Piret方程9-3 常见细胞生长动力学模型（Monod方程和Logistic方程）、产物形成动力学模型（Luedeking-Piret方程）和基质消耗的普遍动力学模型Monod方程：不存在除了单一基质量之外的其它限制细胞生长的条件【Ks半饱和常数】Logistic方程【Xm细胞最大浓度】：基质消耗的普遍动力学模型10 优化和放大10-1 生物过程的研究一般可分为哪几个阶段？10-2 生物过程优化的方法有哪些？单次单因子法统计法Plackett-Burman法、响应面法改进单纯形法10-3 某产物的发酵培养基(g/L) 为葡萄糖50、蛋白胨10 、酵母膏10、KH2PO4 2、MgSO4 1， 请设计Plackett-Burman 的实验方案？10-4 根据文献报道，在机械搅拌通气发酵罐中，黑曲霉葡萄糖氧化酶发酵生产工艺为pH 5.5-6.0，搅拌转速500 rpm，气液比1.0-1.5 vvm，现在某研究人员为了确定自己筛选获得黑曲霉菌种在5 L机械搅拌通气发酵罐中，葡萄糖氧化酶的最佳发酵工艺，请为其设计改进单纯形法的最初4组实验方案。在完成这4组实验后，若第2组产葡萄糖氧化酶最差，请问第5组实验方案如何？序号pH转速（rpm）vvm酶活a5.55001b5.55001.5xc65001d65001.5e(a+b+c)*2/3-b(a+b+c)*2/3-b(a+b+c)*2/3-b精选word范本！