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15 生物技术实践考向预测1.近五年的考题中，对微生物的分离和培养的考查尤为突出，侧重考查微生物的培养、分离、计数、无菌技术等基本知识，对传统发酵技术的发酵原理、制作流程等的考查频度也在不断提高。对植物组织培养、胡萝卜素的提取仅进行了两次考查，前者侧重考查营养条件及有关植物激素的作用等；后者侧重考查胡萝卜素的萃取剂的选择等。2本专题以非选择题的形式考查。常借助某一特定的微生物的分离和培养考查微生物的营养、接种方法等；对于生物技术在食品加工中的应用，常借助发酵实例考查，填充内容多为教材中一些结论性语句等。植物组织培养技术、植物有效成分的提取的考查也多以教材基础知识为主。3考纲新变化：（1）删去了”植物组织培养”，增加了“某种微生物数量的测定”，将“利用微生物进行发酵来生产特定的产物” 改为“利用微生物进行发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用”。2018年备考时应特别关注这些变化，在备考时，可以从以下几个方面来把握： (1)掌握大肠杆菌的纯化原理、主要方法及菌种的保存方法。 (2)认真分析教材中两个微生物分离与计数的实例，并掌握微生物的筛选及技术方法。 (3)利用比较法归纳总结并掌握常见传统发酵技术的原理、流程及影响因素等。 (4)列表比较玫瑰精油、橘皮精油及胡萝卜素的提取方法、原理、实验步骤等异同。考点一微生物的培养、分离与计数1. 消毒和灭菌的比较2. 平板划线法每次灼烧的目的3.纯化微生物的接种方法项目平板划线法稀释涂布平板法原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子胞群体,即菌落将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞,从而能在培养基表面形成单个的菌落优点可以观察菌落特征,对混合菌进行分离可以计数,可以观察菌落特征缺点不能计数吸收量较少,较麻烦,平板不干燥效果不好,容易蔓延4.选择培养基与鉴别培养基的比较例1. 某研究小组的同学用所学的微生物的实验室培养的方法进行“变质牛奶中金黄色葡萄球菌的分离和计数实验”，部分实验处理和结果如图所示。(注：培养皿旁的数字代表菌落数目；实验条件适宜；实验操作规范等)请回答相关问题：(1)在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供合适的_和_条件；另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。(2)据图，研究小组采用的是_法分离和计数金黄色葡萄球菌。由样品到4号试管的操作中，第一步，将分别盛有9 mL生理盐水的4支试管_，并编号14号；第二步，用移液管从样品中吸取1 mL牛奶，注入1号试管中，充分摇匀；第三步，重复第二步骤操作，以此类推。4号试管的稀释倍数是_。(3)资料显示，金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10%15%NaCl肉汤中生长。本实验可配制含10%氯化钠的培养基，使之成为_培养基，以利于金黄色葡萄球菌生长，抑制或阻止其他微生物的生长。(4)在统计菌落数目时，需按照菌落计数的要求计数，以保证计数结果准确。据图可得出1 mL牛奶样品中金黄色葡萄球菌的活菌数为_个。【解题思路】(1)实验室培养微生物，既要为微生物提供营养和适宜温度等环境条件，还要防止被其他微生物污染。(2)图示所用的分离方法是稀释涂布平板法；图示中每一次稀释都稀释了10倍，因此4号试管的稀释倍数为104倍。(3)含有较高浓度NaCl的培养基属于选择培养基。(4)图示中2号试管和4号试管稀释度下各有2个和1个培养皿，偶然性较大，应以3号试管稀释度的数据进行计算，即(323937)30.11033.6105个。【答案】(1)营养环境 (2)稀释涂布平板灭菌 104 (3)选择 (4)3.6105(1)显微镜直接计数法原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。方法：用计数板计数。缺点：不能区分死菌与活菌。(2)间接计数法(活菌计数法)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。考点二传统发酵技术的应用5. 比较果酒、果醋、腐乳、泡菜的制作项目内容果酒和果醋的制作腐乳的制作制作泡菜并检测亚硝酸盐含量作用菌种果酒:酵母菌果醋:醋酸菌毛霉乳酸菌原理(1)酵母菌在无氧条件下将葡萄糖氧化成乙醇(2)醋酸菌在有氧条件下将乙醇氧化为醋酸毛霉将蛋白质、脂肪分解成小分子有机物乳酸菌将糖转化为乳酸原料选择新鲜葡萄(或苹果)豆腐大白菜、花椰菜等新鲜干净的蔬菜发酵条件果酒:前期需氧,后期不需氧果醋:一直需氧一直需氧无氧发酵温度果酒:1825果醋:30351518常温实验流程挑选葡萄榨汁 酒精发酵醋酸发酵 果酒果醋让豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制制泡菜：选材配制盐水加调味料,装坛发酵成品测亚硝酸盐含量:配制溶液制备标准显色液制备样品处理液比色例2. 将醋酸菌突变体中与耐酸有关的ALDH基因导入优良醋酸菌中，选育出高发酵速率、耐酸的醋酸菌，用于果醋生产。请分析回答下列问题：(1)对含有ALDH基因的DNA与质粒用同种限制酶切割后，通过_酶连接形成重组质粒。为获得耐酸的醋酸菌，用_法接种于含高浓度醋酸的培养基进行筛选。将筛选纯化的菌种用_的方法长期保存。(2)下图表示温度、乙醇浓度对该醋酸菌产酸量的影响。醋酸菌能将乙醇转变为_，再将其转变为醋酸。研究不同酒精浓度下的最高产酸量时，最好把温度控制为_，如温度过高，醋酸菌代谢缓慢甚至死亡，原因是_。酒精发酵后通过出料口检测酒精浓度，将发酵液中酒精浓度调节到_左右才接种醋酸菌，较高的酒精浓度会使产酸量下降，不适宜接种，原因是_。(3)为检测发酵过程中醋酸菌数量，将1 mL发酵液稀释100倍后，分别取0.1 mL稀释菌液均匀涂布在4个平板上；经适当培养后，4个平板上的菌落数分别为24、139、140、141，据此可得出每毫升发酵液中的活菌数为_。【解题思路】(1)DNA连接酶作用是连接两条DNA链；微生物接种常用方法是平板划线法和稀释涂布平板法；甘油管藏的方法适合长期保存菌种。(2)由图1，可以看出在35，产酸量最多，因此温度应控制在35，温度过高，影响酶的活性，醋酸菌代谢缓慢甚至死亡；由图2，可以看出在乙醇浓度为4%时，产酸量最高高浓度的酒精会抑制醋酸菌的生长和代谢。(3)第1个平板的菌落数为24，与其他平板差别太大，可能由偶发因素引起的，应取菌落数目介于30300的计数，因此取后3个平板菌落数平均值为(139140141)/3140，那么1 mL发酵液活菌数目为140101001.4105。【答案】（1）DNA连接平板划线(稀释涂布平板) 甘油管藏（2）乙醛35(3035) 温度过高，影响酶的活性(使酶失活) 4% (较)高浓度的酒精会抑制醋酸菌的生长和代谢（3）1.4105考点二植物有效成分的提取6. 植物有效成分的提取实例(1)玫瑰精油的提取注意：加入NaCl的目的是增加水层的密度，有利于玫瑰油与水分层。加入无水Na2SO4的目的是吸收精油中残留的水分。(2)橘皮精油的提取注意：为了提高出油率，需要将柑橘皮干燥去水，并用石灰水浸泡，浸泡时间为10 h以上。橘皮要浸透，这样压榨时不会滑脱，且出油率高，过滤时不会堵塞筛眼。(3)胡萝卜素的提取注意：原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等条件也能影响萃取效率。因此在萃取的过程中，要先将胡萝卜进行粉碎和干燥，使之与萃取剂充分接触，提高溶解度。例3. 请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题：(1)植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、_和_。(2)芳香油溶解性的特点是不溶于_，易溶于_，因此可用_作为提取剂来提取芳香油。(3)橘子果实含有芳香油，通常可用_作为材料提取芳香油，而且提取时往往选用新鲜的材料，理由是_。(4)对材料压榨后可得到糊状液体，为除去其中的固体物获得乳状液可采用的方法是_。(5)得到的乳状液加入氯化钠并放置一段时间后，芳香油将分布于液体的_层，原因是。加入氯化钠的作用是_。(6)从乳状液中分离得到的芳香油中要加入无水硫酸钠，此试剂的作用是_。【解题思路】(1)植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、蒸馏法、萃取法。(2)见答案。(3)一般采用新鲜的橘子皮来提取橘皮精油，因为新鲜的橘皮中含芳香油多。(4)除去液体中的固体常用方法是过滤。(5)芳香油密度比水小，且不溶于水，会浮在液体的表面。加入氯化钠会增加水层密度，使油和水分层。(6)无水硫酸钠可以吸收芳香油中残留的水分。【答案】(1)蒸馏法萃取法(2)水有机溶剂有机溶剂(其他合理答案也可)(3)橘子皮芳香油含量较高(4)过滤(其他合理答案也可)(5)上油层的密度比水层小(其他合理答案也可)增加水层密度，使油和水分层(6)吸收芳香油中残留的水分1.水蒸气蒸馏法有水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏三种方法，应根据不同的原料选择不同的蒸馏方法。2.压榨法必须在常温条件下进行，否则会影响产物的产量和质量。3.萃取法就是根据相似相溶原理，根据不同物质的不同沸点来蒸发或分液。4.虽然三种方法的原理和操作过程不同，但都有过滤提纯这一环节。5.在实际生产中要根据原料特点的不同，采用适宜的提取方法。1（2018全国卷I)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：（1）M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素一抑制_的生长，加入了链霉素的培养基属于_培养基。（2）M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有_（答出两点即可）。氮源进入细菌后，可参与合成的生物大分子有_（答出两点即可）。（3）若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产生淀粉酶的微生物，加入的显色剂是_，该方法能筛选出产生淀粉酶微生物的原理。（4）甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133。乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是：。2（2018全国卷III)回答下列与酵母菌有关的问题：（1）分离培养酵母菌通常使用_（填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”）培养基，该培养基应采用_灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后会观察到菌落，菌落的含义是_。（2）酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进_（填“菌体快速增殖”、“乙醇产生”或“乳酸产生”）；若进行厌氧培养，可促进_（填“菌体快速增殖”、“乙醇产生”或“乳酸产生”）。（3）制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是_。1（2018届河南省安阳市高三上学期第一次模拟）中央电视台舌尖上的中国栏目介绍了我国各地的美食，其中利用发酵技术制作的各类特色食品，如果醋、腐乳、泡菜等，很好的展现了广大人民群众的智慧。请回答下列问题：（1）“天地一号”苹果醋是我国著名的果醋。工业上酿制苹果醋通常有两条途径，一条途径是向捣碎的苹果汁中直接接种_（填微生物名称）。经过一次发酵制成，在发酵过程中需要经常向发酵液中通入_；另一条途径需经过先后两次发酵获得，即_。（2）“王致和”腐乳是我国的著名品牌，通过发酵，豆腐中营养物质的种类_（填“增多”或“减少”）。制作腐乳时加盐腌制后需要加入卤汤，若卤汤中的酒精含量过高，则会导致腐乳_。（3）泡菜具有独特的风味，在我国的泡菜品种中，东北酸菜和四川泡菜都非常有名，它们的制作过程基本类似，都是利用_（微生物名称）发酵。向坛中注入盐水前，煮沸所用盐水的目的是_。在泡菜制作过程中，亚硝酸盐含量的变化情况是_。2（2018届河北省衡水中学高三第十七次模拟）青蒿素是一种无色针状晶体，易溶于有机溶剂，不溶于水，不易挥发，60以上易分解，主要从黄花蒿中提取。近年来又发现青蒿素具有较强的抗肿瘤作用，某科研小组按如下步骤进行了相关实验：从黄花蒿中提取青蒿素；将等量癌细胞分别接种到4组培养瓶中，适宜条件下培养24h后除去上清液；向4组培养瓶中分别加入等量含2、4、8，16mol/L青蒿素的培养液，适宜条件下继续培养；72h后统计并计算各组的细胞增殖抑制率。回答下列问题：（1）提取青蒿素时不宜使用水蒸气蒸馏法，原因是_；根据青蒿素_的特点，可采用有机溶剂萃取的方法，现有四氯化碳(沸点76.5)和乙醚(沸点34.5)两种溶剂，应选用_作为萃取剂，不选用另外一种的理由是_。（2）萃取青蒿素的过程应采用_加热；加热时常在加热瓶口安装回流冷凝装罝，目的是。（3）科研小组进行上述步骤实验的目的是_。步骤中需要设罝对照组，对照组的处理方法为_。1（2019届四川外国语大学附属外国语学校高三10月月考）请回答关于果酒、果醋、腐乳和泡菜制作的问题。（1）葡萄酒是最受欢迎的果酒之一，葡萄酒发酵过程中，需将温度控制在_。发酵过程中，在条件_下，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物受抑制。若要让发酵装置由产葡萄酒转变成产葡萄醋，则需要要改变的条件_。（2）腐乳的制作是利用毛霉产生的_将豆腐中的蛋白质和脂肪分解。加盐腌制的主要目的是析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬；同时还能_，避免豆腐块腐败变质。（3）泡菜是川渝地区家喻户晓的开胃小菜，泡菜发酵的原理是_；一般地说，泡菜腌制14天后，亚硝酸盐含量低，适合食用，实验室用_法检测其含量。2（2019届甘肃省静宁县第一中学高三第四次模拟）酸奶是牛奶经过乳酸菌（主要是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）发酵制成的。乳酸菌可将牛奶中的乳糖转化为乳酸，从而减轻某些人群的乳糖不耐受症状。请回答问题：（1）为鉴别市售酸奶中的菌种，应该采用平板划线法或_法在固体培养基上进行接种，观察所获单菌落的特征。（2）采用平板划线法分离水样中的乳酸菌。操作时，接种环通过_灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是_。（3）某同学在配制平板时加入CaCO3，从而成功筛选出能产生乳酸的菌株，其筛选依据的原理是_。并且单菌落周围_越大，说明该菌株产生乳酸的能力越强。（4）发酵到后期时，酸奶含量继续增加，当达到1.2%以上时，发酵速度逐渐变缓甚至停止，主要原因是_。（5）含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶，其理由是_。参考答案1.【解题思路】（1）M培养基若用于真菌的筛选，说明M培养基能满足真菌的生长，而能抑制其它微生物的生长，链霉素是一种抗生素，可以抑制细菌的生长。加入了链霉素的培养基能筛选出真菌，该培养基属于选择培养基。（2）微生物生长需要多种营养物质除氮源外，还需要碳源、无机盐、水以及特殊营养物质等。氮元素是蛋白质和核酸等生物大分子的组成元素，因此氮源进入细胞后,可参与合成的生物大分子有蛋白质和核酸。（3）淀粉与碘液会变成蓝色，筛选产淀粉酶的微生物，依据淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈，再根据透明圈，来筛选产淀粉酶的微生物。（4）乙同学结果不合理，因为1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差，不能简单的用其平均数作为最终结果。【答案】（1）细菌选择（2）碳源、无机盐蛋白质、DNA、RNA （3）碘液淀粉遇碘显蓝色，产淀粉酶菌落周围淀粉被水解，形成透明圈（4）乙同学的结果中，1个平板的计数与另2个相差悬殊，结果的重复性差2.【解题思路】（1）麦芽汁琼脂培养基的碳氮比较高，而且含糖量高，更适合酵母菌；该培养基应采用高压蒸汽灭菌法灭菌；若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落；（2）酵母菌液体培养时，若通入氧气，进行有氧呼吸产生H2O和CO2，释放能量多，细胞增殖快；若进行无氧培养，进行无氧呼吸，产生酒精和CO2，释放能量少，增殖慢；（3）制作面包时，在面粉中添加一定量的酵母菌，因酵母菌可以分解面粉中的葡萄糖，产生二氧化碳，二氧化碳是气体，遇热膨胀而形成小孔，使得面包松软多孔。【答案】（1）麦芽汁琼脂高压蒸汽由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体（2）菌体快速增殖乙醇产生（3）酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软1.【解题思路】（1）由于醋酸菌是需氧型微生物，所以它在发酵过程中需要不断向发酵液中通入无菌空气；如果糖原（苹果汁）充足，可直接接种醋酸菌进行有氧发酵产生苹果醋；如果糖原不充足，可先通过酵母菌发酵制得果酒，再向果酒中接种醋酸菌进行有氧发酵制成苹果醋。（2）根据前面的分析可知，豆腐通过霉菌分泌的酶分解，其中营养物质的种类会增多。制作腐乳时加盐腌制后需要加入卤汤，若卤汤中的酒精含量过高，会破坏霉菌产生的部分发酵酶，进而则会导致腐乳成熟时间延长。（3）泡菜都是利用乳酸菌发酵制成。向泡菜坛中注入盐水前，煮沸所用盐水的目的主要是杀灭细菌，其次有除去部分溶解氧。在泡菜制作过程中，亚硝酸盐含量的变化情况是先增加后减少。【答案】（1）醋酸菌无菌空气先接种酵母菌获得果酒，再在果酒中接种醋酸菌进一步获得果醋（2）增多成熟时间延长（3）乳酸菌杀灭细菌（或灭菌）先增加后减少2.【解题思路】（1）青蒿素不易挥发，不能随水蒸气蒸馏出来(或水蒸气蒸馏法适用于蒸馏挥发性物质，而青蒿素不易挥发），所以提取青蒿素时不宜使用水蒸气蒸馏法；根据青蒿素易溶于有机溶剂的特点，可采用有机溶剂萃取的方法；根据题意可知，青蒿素在60以上易分解，因此应选择低沸点的乙醚作为萃取剂。（2）由于有机溶剂易燃，所以萃取靑蒿素的过程应采用水浴加热；为防止有机溶剂挥发，加热时可在加热瓶口安装回流冷凝装置。（3）上述步骤实验的目的是探究青蒿素的浓度与细胞增殖抑制率的关系；步骤中缺少空白对照组，需要设置一组加入等量的不含青蒿素的培养液，在适宜条件下培养作为对照组，以排除细胞自身原因的死亡。【答案】（1）青蒿素不易挥发，不能随水蒸气蒸馏出来(或水蒸气蒸馏法适用于蒸馏挥发性物质，而青蒿素不易挥发）易溶于有机溶剂乙醚青蒿素在60以上易分解，应选择低沸点的萃取剂（2）水浴防止有机溶剂挥发（3）探究青蒿素的浓度与细胞增殖抑制率的关系在另一培养瓶中加入等量的不含青蒿素的培养液，适宜条件下继续培养1.【解题思路】（1）酵母菌发酵产生酒精需要的温度条件是18-25，在发酵的无氧、酸性条件下，酵母菌可以生长繁殖，而其他微生物不可以；醋酸菌是好氧菌，在有氧的条件下产生醋酸，因此若要让发酵装置由产葡萄酒转变成产葡萄醋，应该改变的条件有：加入醋酸菌，充入无菌空气，提高发酵温度。（2）毛霉产生的蛋白酶和脂肪酶可以将豆腐中的蛋白质和脂肪水解；加盐腌制的作用是析出豆腐内的水分，也可以抑制微生物生长。（3）泡菜发酵的原理是乳酸菌在无氧条件下将葡萄糖分解成乳酸；实验室常用比色法检测发酵过程中产生的亚硝酸盐的含量。【答案】（1）18-25无氧、酸性加入醋酸菌，充入无菌空气，提高发酵温度（2）蛋白酶和脂肪酶抑制微生物的生长繁殖（3）无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸比色2.【解题思路】（1）微生物常见的接种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法法，鉴别培养基中，一般需要加入琼脂作为凝固剂制成固体培养基，然后观察所获单菌落的特征。（2）微生物培养的关键是无菌操作，将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具都需要进行灭菌。操作时，接种环通过灼烧灭菌。平板划线法分离水样中的乳酸菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是通过划线次数的增加，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。（3）某同学在配制平板时加入CaCO3，从而成功筛选出高效产生乳酸的菌株，其筛选依据的原理是乳酸会与CaCO3反应形成透明圈，透明圈直径越大，产生乳酸能力越强。（4）发酵到后期时，酸奶含量继续增加，当达到1.2%以上时，发酵速度逐渐变缓甚至停止，主要原因是pH过低，乳酸杆菌生存环境过于恶劣，乳酸杆菌与环境斗争处于劣势而导致其生命活动（发酵）受到抑制。（5）抗生素能够杀死或抑制乳酸菌的生长，因此含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶。【答案】（1）稀释涂布平板法（2）灼烧将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落（3）生成的乳酸与CaCO3反应生成乳酸钙，周围形成透明圈透明圈（4）pH过低抑制了乳酸菌的生长（5）抗生素能够杀死或抑制乳酸菌的生长
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