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1动物源性 I 型胶原蛋白成分测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法国家标准编 制 说 明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会国标委综合201841 号 ，项目编号“20180923-T-424”。本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于 2020 年完成。本标准由中国科学院海岸带研究所等单位共同组成。二、目的和意义胶原蛋白（Collagen ）是多细胞生物中含量最丰富、分布最广泛的蛋白质种类之一。在生物体内，胶原蛋白与聚多糖等成分一起形成精密有序的细胞间网络结构细胞外基质（extracellular matrix，ECM） ，对机体细胞的发育、迁移以及机体组织的形成和功能发挥等均产生重要作用。有关胶原的研究与应用历史悠久。5000 多年前，当如毛发之类的材料首次作为医用缝合线时，胶原“肠线” 便得到了相应的发展，并用于伤口缝合。人们最初是通过鞣制胶原将皮革和皮毛进行防腐处理，以便得到易于保存、干燥后仍能机械助软的皮革。但是，由于胶原来源、结构与性能的复杂性，加上测试与研究设备的局限性，尽管人们已经广泛使用了胶原，但对其结构和性能的研究仍然不足。近年来，随着现代科学与技术的发展，相关领域的研究不断深入；同时分析与测试设备的日臻完善，也为胶原的深入研究创造了条件。另外，在资源、环境及可持续发展面临的问题日益严峻的今天，作为一种可再生资源的胶原，备受人们的关注，表现在人们对胶原所进行的应用研究开发工作逐渐增多，也许多方面均有不少突破。胶原已广泛应用于可食性包装材料、可降解日用品材料、胶原蛋白合成纤维等领域，由于胶原蛋白具有良好的生物相容性并能促进机体细胞的生长、迁移和增生，因此被广泛应用于生物医学材料、医学组织工程和医学美容等领域。如胶原海绵在创伤修复、快速止血中的应用 ；胶原胶在面部皮肤除皱、靶向药物制备及药物缓释中的应用；胶原复合材料在人造血管、人造皮肤和骨骼、人工眼角膜移植等医学组织工程中的应用。 2018 年我国医疗器械市场 5650 亿元，其中生物植入材料约 722 亿，胶原基生物植入材料约 377 亿（止血材料约 19 亿） ，年复合增长率 21.67 %。2018 年我国化妆品市场规模 1800 亿元，含胶原化妆品 125 亿元(占 7 %)，2年增长率 12 %；市场已有含胶原化妆品 620 种，国产产品仅 32 种，约占 5 %。胶原的种类很多，到目前为止，已经报道的基于化学结构上不同类型的胶原有 27 种，其中 I 型胶原占全部蛋白含量的 90%以上，因此，在生物医学领域，研究最广泛的是 I 型胶原。I 型胶原主要分布于骨、肌腱、韧带、皮肤等组织，目前 I 型胶原大多数是从哺乳动物的皮肤、肌腱与骨骼中提取，例如牛皮、牛肌腱、以及猪和牛骨。另外，还有部分学者从海洋和水产鱼类的皮肤中提取 I 型胶原。I 型胶原来源广泛，价廉易得，且性能优良，是一种不可多得的天然生物高分子材料 。I 型胶原的结构由 2 条相同的 1链和 1 条不同的 2链组成，33% 的甘氨酸、10% 的脯氨酸和的 10% 羟脯氨酸构成一条具有特征性的重复构型胶原肽链（ 链） ，这种独特的氨基酸序列提供了一个 II 型聚脯氨酸的左手螺旋结构，在胶原形成的过程中，3 条平行的 II 型聚脯氨酸的左手螺旋结构互相旋转缠绕形成一条右手三螺旋结构，被称为原胶原分子，一个胶原纤维片段或是原纤维包含 5 个平行的原胶原分子，氢键提供螺旋结构最初的结合，共价键提供附加的稳定。I 型胶原是一种最重要的细胞外基质蛋白，在支持与连接组织中起到重要的作用。由于其独特的纤维状结构及优良的生物学特性，使其得到广泛的关注。其优点可以集中体现为：良好的生物相容性、移除端肽后较低的抗原性、具有一定的粘附性和纤维不松脆性、吸水性、可缝合、较高的孔隙率可以为新生组织提供空间、其纤维可以整合进新生组织基质、可以与其他材料相结合、液压可以被转导等。胶原支架或凝胶如果应用于体内的话，会承受来自人体的生理或病理状态下的机械载荷，因此，保持它们结构和功能就显得尤为重要，另外，三螺旋结构完整性的 I 型胶原，具备较低的细胞毒性、更优良的生物相容性和生物可降解性，对于其在功能化妆品、功能食品和生物医用材料和组织工程如软骨组织工程、血管组织工程、人工皮肤肌腱等商业、生物领域的应用具有重要意义。目前，对于胶原三股螺旋完整性构象的检测方法众多，但或多或少都会有一定的局限性，急需建立统一有效的的标准化检测方法。三、标准制定原则（一）标准编制原则本标准按照 GB/T1.1-2009 给出的规则起草。标准编制遵循 “统一性、协调性、适用性、一致性、规范性”的原则。本标准是在广泛调查研究的基础上制定的。（二）标准制订主要依据31、标准编写遵循 GB1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则的有关要求。2、标准编写内容参考我国与农产品相关的法规、标准，包括 GB/T 9695.23 肉与肉制品羟脯氨酸含量测定、GB/T 23527 蛋白酶制剂、GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法、GB 6011988 标准滴定溶液的配制和标定、 NYT 1663-2008 乳与乳制品中 -乳球蛋白的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法、 YY/T 1453-2016 组织工程医疗器械产品 型胶原蛋白表征方法等。四、标准主要技术内容1 术语与定义I 型胶原是指在广泛存在于动物体中的一种结构蛋白，起到支撑作用并能聚集成纤维，是胶原纤维组分中的一部分。它来源于表达在胶原 链上的 COLIA1 和 COLIA2 基因。所有的胶原均具有由三条聚肽链单元组成的三螺旋结构，其分子结构中具有典型的“Gly-X-Y”三肽重复序列（脯氨酸经常占据 X 位，羟脯氨酸占据 Y 位） 。I 型胶原富含甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸和 4-羟脯氨酸，含少量的硫且不含 L-色氨酸。羟脯氨酸是一种胶原蛋白特有的氨基酸，约占胶原蛋白的 9% - 13%，I 型胶原蛋白纤维能自然的溶解在稀酸和稀碱中。加热到 40以上后胶原蛋白可变性成单 -链（明胶） 。I 型胶原的三螺旋结构是由三条 链组成的右手三螺旋结构，形成螺旋结构的三条 链可以是相同的，也可以由两种或三种不同的 链组成，三条链依次交错排列，以右手螺旋围绕中心轴线形成一种三螺旋结构。如果三螺旋结构在提取过程中没有因为酶、热等原因发生解螺旋情况，则称其具有三螺旋结构，相对应，部分解螺旋的胶原用百分含量表示。2 型胶原的检测原理I 型胶原最典型的结构特征是三螺旋结构，在 链围绕中心轴线形成 的三螺旋结构中，所有的甘氨酸位于螺旋的中心，体积较大的侧链占据外围区域。这种氨基酸组成有利于三条单链围绕轴线紧密缠绕。自然的三螺旋具有抵抗如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的能力，只能被特异的胶原酶水解。因此可以用酶法判断 I 型胶原三股螺旋结构。3 测定步骤43.1 试样制备3.1.1 胶原原样的试样前处理方法称取 1g 样品，精确到 0.1mg，加适量 0.5M 乙酸溶解，定容至 10mL。取 10mL 液体样品，磁力搅拌器搅拌 4h，离心 5min，取上清液分装，在 4保存，备用。3.1.2 胶原制品的试样前处理方法支架材料：将胶原支架裁剪成尺寸为 10 mm10 mm24 mm 的试样，浸泡在 PBS 溶液中，以备实验使用。按 7.1.1 操作。 补片：将胶原补片裁剪成尺寸为 10 mm10 mm24 mm 的试样；再将裁剪后的试样清洗浸泡在 0.1%40% (W/V)的碱溶液中，浸泡 0.5 24h。清洗至 PH 为 5 8 后生理盐水浸泡约 0.5 - 48h，沥去多余水分，2 8组织捣碎后分散进酶解液中， 2 40环境酶解1 72h；酶解完毕后调 PH 值至 7 13，2 - 40静置 2 24h；30150 目滤网过滤，去除未酶解物。20%-50%(W/V) 盐溶液盐析，收集固形物，截留分子量为 40008000 的透析袋透析，去除多余离子和杂质，获得多型胶原，最后将多型胶原混合物分散至水中，调 pH值至 15，30150 目滤网过滤，去除析出物，将滤液盐析后透析，即可得到胶原。按7.1.1 操作。敷料：将胶原敷料裁剪成尺寸为 10 mm10 mm24 mm 的试样，浸泡在 PBS 溶液中，以备实验使用。按 7.1.1 操作。3.2 前处理将待测的 7.1 的样品平均分成两组，每组两只试管。一组于 60水浴进行加热30min，称 A 管，另一组暂不做处理，称为 B 管。将两组样品中分别加入 10 000 20 000 U/g 胃蛋白酶溶液，在 20（酶最适温度）反应 5min 后取出。取 A、B 反应液，加入样品制备液，100加热 5min 以使蛋白质变性，制备电泳样品。3.3 分离胶制备按表 1 配制 12%分离胶 20mL，混匀后加入到长短玻璃间的缝隙中，约 60mm70mm高。沿长玻璃板板壁缓慢注入约 5mm 高的水，进行水封。约 30min 后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合，倾倒去水封层的水，再用滤纸条吸去多5余水分。3.4 浓缩胶制备按表 1 配制 3 % 浓缩胶 10 mL，混匀后加入到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约 5mm 处。轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约 30min 后凝胶聚合，再放置20min 30min，使凝胶老化。表 1 不连续凝胶的凝胶配方（垂直电泳）贮液 3%浓缩胶 12%分离胶丙烯酰胺单体贮备液 2.5 mL 12 mL浓缩胶缓冲液贮备液 0.6 mL /分离胶缓冲液贮备液 / 7.5 mL十二烷基磺酸钠溶液 50 L 300 L水 1.82 mL 10 LN, N, N, N-四甲基乙二胺溶液 5 L 20 L过硫酸铵溶液 25 L 200 L五、主要工作过程1、组成标准起草小组标准制定任务下达后，2014 年 6 月，组成了标准起草工作组，明确了任务要求，安排了工作进度，成立了标准起草工作小组。会议研究讨论了当前 I 型胶原三股螺旋完整性构象的多种检测方法，但或多或少都会有一定的局限性，急需建立统一有效的的标准化检测方法，并提出了聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定动物源性 I 型胶原蛋白三股螺旋结构的可行性。2、开展相关调研情况为了更好的确定动物源性 I 型胶原蛋白三股螺旋结构测定的方法，判定聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定动物源性 I 型胶原蛋白三股螺旋结构的可行性，从 2014 年中旬开始，起草工作小组历时一年的时间，开展了国内外相关法律法规及标准情况调研工作。在调研中，主要查阅了国内外涉及胶原的相关标准。国内相关产品标准有 GB/T 22729-2008海洋鱼低聚肽粉 、YY/T 1453-2016 组织工程医疗器械产品 型胶原蛋白表征方法 。国际上胶原的相关标准及检测方法如下所示：标准号 标准名称 备注6ASTMF2212-2009 作为组织工程医疗产品用外科植入物和底层原 材料的 I 型胶原特性的标准指南 美国材料实验协会ASTMF2212-2011 医用组织加固产品外科移植和培养基中作为开 始材料的类型 I 胶原质的特性描述标准指南 美国材料实验协会DIN58924-2009 止血学 VWF 的胶原质粘合活性的测定用参考方 法 德国的标准化主管机 关（非政府）NFV04-415-2002 肉 ,肉制品和水产品.L 羟基脯氨酸含量的测定 法国标准（法国标准 化协会）NFV59-201-1988 骨胶原.羟基脯氨酸含量的测定 法国标准（法国标准 化协会）NFV59-202-1988 骨胶原.氮含量的测定 法国标准（法国标准 化协会）NFV59-203-1988 骨胶原.干物质的测定.脱水重量的损失 法国标准（法国标准 化协会）NFV59-204-1988 骨胶原.矿物质的测定.灰分 法国标准（法国标准 化协会）STAS9065/13-81 肉和肉品胶原蛋白含量检测 罗马尼亚标准可食用明胶检测标准 美国明胶生产商院C.A.S.NO.9000-70-8 国际通用可食用明胶出口标准 国际食品添加剂出口 委员会标准 JECFACAC/GL 21 - 1997建立及应用食品微生物标准的指南和准则（Principles and Guidelines for the Establishmentand Application of Microbiological Criteria Related to Foods）国际法典标准日本胶原蛋白肽品质规格 日本明胶胶原蛋白肽 工业协会3、标准起草完善过程依据 GB/T 1.12000标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则 、GB/T 1.22002标准化工作导则 第 2 部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法等标准编制要求，对动物源性 I 型胶原三股螺旋结构测定标准开展了研制工作，起草组分别于 2014 年 9 月、2015 年 4 月、2016 年 5 月、2017 年 8 月召开五次工作组会议，并以电话、邮件形式多次与相关专家进行沟通，先后讨论了标准的地位、起草原则、框架、基本内容、核心条款等内容，并征求了企业、协会等相关单位意见，完成了动物源性 I型胶原三股螺旋结构测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法国家标准（草案） 。在此基础上，2018 年 11 月征求了专家意见，起草组按照专家意见对标准内容进行了修改完善，形成了标准征求意见稿。六、方法验证及结果7验证单位 试样 方法 结果山东省淡水渔业研究院多种淡水鱼类提取的胶原试样 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 可行淮海工学院鱼皮、鱼鳞、鱼骨酸溶性胶原蛋白及酶促溶性胶原试样聚丙烯酰胺凝胶电泳法 可行七、与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系本标准符合国家现行法律、法规、规章和强制性国家标准的要求，本标准有助于动物源性 I 型胶原三股螺旋结构测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法等相关法律、法规、规章和强制性国家标准的实施。本标准的实施不涉及对现行标准的废止情况。八、标准属性的建议本标准属于基础管理标准，建议作为推荐性标准批准发布。九、贯彻国家标准的要求和措施建议本标准可作为检测动物源性 I 型胶原蛋白三螺旋结构完整性的推荐标准。
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