利用各组分在固定相和流动.ppt

色谱法 第六章 色谱法利用各组分在固定相和流动相之间分配系数的差异得到分离 再逐个进行分析 是分离 分析同时进行的一类分析方法 高效液相色谱法 HPLC 气相色谱法 GC 薄层色谱法 TLC 常用的色谱法 1 分配系数 K 各组分在固定相和流动相之间达到平衡时的浓度之比 2 容量因子 k 质量分配系数 各组分在固定相和流动相之间达到平衡时的质量之比 k kA kB是分离的先决条件 容量因子 k 质量分配系数 不仅与被测组分 固定相 流动相及温度有关 还与两相体积有关 容量因子比分配系数更易测定 3 色谱过程方程保留时间与分配系数的关系 第一节薄层色谱法 薄层色谱法 TLC法 将固定相涂布在玻璃 塑料或金属板上形成薄层 在此薄层上进行色谱分离的方法 简便 快速 灵敏 高选择性 显色方便 1 吸附薄层色谱的分离原理点在薄层板上的样品不断地被吸附剂吸附和被展开剂溶解而解吸 并随展开剂向前移动 从而产生差速迁移得到分离 一 基本原理 2 比移值 Rf最佳范围0 3 0 5可用范围0 2 0 8 3 分离度 分辨率 R 薄层板上两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度的比值 色谱图上两色谱峰顶尖距离与两色谱峰的峰宽和之比 二 操作方法 1 吸附剂 活化105 110 加热30 硅胶活性强弱与含水量有关 水分越高活性越低 吸附力越小 硅胶H 硅胶HF254硅胶G 硅胶GF254 一 吸附剂和展开剂的选择 1 硅胶 2 氧化铝酸性 中性和碱性 活性与含水量有关 3 聚酰胺表面有酰胺基 可与酚 羧酸 氨基酸等形成氢键 2 展开剂 极性较强组分活性低的薄层板极性较强的展开剂极性较弱组分活性高的薄层板极性较弱的展开剂 二 薄层板的制备 三 点样与展开 四 斑点的定位 普通板日光下 直接或显色 紫外灯下 荧光 荧光板荧光淬灭 三 应用 一 鉴别对照品法比较供试品与对照品的Rf值及颜色是否一致 二 检查 供试品 供试品溶液 杂质对照品 对照品溶液 1 杂质对照品法 优点 同一物质 同一Rf值比较 准确度高 直观性强 缺点 需要杂质对照品 2 高低浓度对比法以供试品溶液的稀溶液作为对照液 A 供试品所显杂质斑点与对照液主斑点比较 不得更深B 规定供试品杂质斑点的个数 缺点 不同物质 不同Rf值的比较 准确度差 直观性差 优点 以供试品的稀溶液作为对照液 不需要杂质对照品 简单 价廉 还可配成几种限量的对照溶液 01 79 以硅胶为固定相的薄层色谱按作用机制属于A 吸附色谱B 离子交换色谱C 胶束色谱D 分子排阻色谱E 亲合色谱 例1 TLC法中 各分离组分的Rf值最佳范围是A 0 2 0 8B 0 3 0 5C 0 3 0 8D 0 5 0 8E 0 2 0 3 第二节气相色谱法和高效液相色谱法 一 气相色谱法 GC法 以气体为流动相的色谱法 一 基本原理各组分在固定相与载气之间由于分配系数不同而按不同顺序被带出 分配系数小的组分先流出 分配系数大的后流出 优点灵敏度高 样品用量少分离效能高 分离速度快 缺点受样品蒸气压的限制不适于难气化和热稳定性差的药物 1 基本概念 峰高峰面积峰位 保留值 用于定性峰宽用于衡量柱效 保留值可用时间或体积表示 1 保留时间 tR 2 死时间 t0 3 调整保留时间 t R 色谱区域宽度 1 标准差 0 607h的W 2 2 半峰宽 Wh 2 3 峰宽 W 2 塔板理论 基本假设色谱柱中有无数塔板 样品在每个塔板内的气 液两相进行分配 理论塔板数 塔板数越多 塔板高度越小 柱效越高 3 速率理论VanDeemter方程 塔板高度 涡流扩散 纵向扩散 载气速度 传质阻抗 二 气相色谱法分类 填充柱色谱法 粗 毛细管柱色谱法 细 气 固色谱法 吸附柱 气 液色谱法 分配柱 三 常用固定液与载体 1 固定液鲨鱼烷 SE 30 OV 17 聚乙二醇 2 载体硅藻土型载体 红色 白色 3 毛细管色谱柱开管型毛细管柱 WCOT SCOT 填充型毛细管柱 四 气相色谱仪气源进样及气化系统色谱柱和柱温箱检测器热导检测器氢火焰离子化检测器电子捕获检测器 ChP 2000 对气相色谱仪的一般要求色谱柱填充柱或毛细管柱 空心柱 固定液高沸点液体载气氮气检测器氢火焰离子化检测器 FID 检测温度高于柱温一般250 350 96 128 在气相色谱法中 与含量成正比的是色谱峰的A 保留体积B 保留时间C 相对保留值D 峰高E 峰面积 00 75 在色谱分离中 组分达到平衡时 在固定相中的质量为Ws 浓度为Cs 在流动相中的质量为Wm 浓度为Cm 则此组分的容量因子为A Cs CmB Cm WsC Ws WmD Wm WsE Ws Cs Wm Cm 例1 气相色谱法可测定的药物为A 沸点低于450 B 沸点低于550 C 沸点在450 以上D 无机药物E 热不稳定药物 例2 气相色谱仪组成部分应有A 气路系统B 进样系统C 分离系统D 检测系统E 记录系统 二 高效液相色谱法 HPLC法 以液体为流动相的色谱法 一 HPLC的速率理论 与气相色谱法的差别GC法高温 ChP50 265 纵向扩散项大 B u HPLC法室温传质阻抗项大 Cu 1 液 固吸附色谱法固定相常用硅胶流动相烷烃 极性调整剂 二 各类HPLC法 2 液 液分配色谱法固定相目前大多是用化学方法将固定液键合在载体 硅胶 上所形成 即化学键合相 1 正相色谱法流动相极性 固定相极性分析亲脂性的极性及中等极性的分子型药物极性弱的组分先流出色谱柱 2 反相色谱法 RP HPLC 流动相极性 固定相极性分析非极性 中等极性药物极性强的组分先流出色谱柱固定相ODS C18 辛烷基 C8 流动相甲醇 水 乙腈 水 3 反相离子对色谱法 PIC 如样品在极性流动相中可解离为离子 若将离子对试剂加入流动相 与被分析离子生成中性离子 即可增大样品在非极性固定相中的溶解度 4 离子抑制色谱法 ISC 测定弱酸 弱碱类药物时 通过调整流动相pH值 抑制样品的解离 以增大样品在非极性固定相中的溶解度适用于弱酸 3 0 pKa 7 0 弱碱 7 0 pKb 8 0 三 常用固定相 1 硅胶用于吸附色谱 2 化学键合相非极性ODS 十八烷基键合相 极性氨基 氰基键合相 3 键合型离子交换剂 四 高效液相色谱仪高压输液泵色谱柱柱管 固定相进样阀六通阀 有定量环 检测器紫外吸收检测器荧光检测器差示折光检测器电化学检测器 中国药典规定正文各品种项下的HPLC条件 不得任意改变固定相种类 流动相组分 检测器类型 可适当改变色谱柱内径 长度 固定相牌号 载体粒度 流动相流速和比例 柱温 进样量 灵敏度 三 系统适用性试验ChP每次检测前 应对仪器进适用性试验 应达到规定要求理论板数 n 分离度 R 重复性 RSD 拖尾因子 T 一 理论板数 n 如测得n低于规定 应改变柱长或载体性能 重填色谱柱等以求达到 二 分离度 R 除另有规定外 R 1 5 三 重复性 RSD 1 53 3 四 拖尾因子 T 除另有规定外 T应0 95 1 05 四 GC和HPLC在药品检验中的应用1 鉴别在相同的色谱条件下 分别取供试品溶液和对照品溶液进样 记录色谱图 供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液一致 2 杂质检查内标法 加校正因子 外标法主成分自身对照法 加校正因子 主成分自身对照法 无校正因子 面积归一化法 1 内标法 校正因子 内标 杂质对照品 计算校正因子 内标 样品 计算杂质含量 优点准确 内标物 杂质对照品 校正因子 内标物 样品 杂质含量 2 外标法 供试品 供试品溶液 杂质对照品 对照品溶液 缺点不易控制进样量宜用定量环 3 加校正因子的主成分自身对照法 待测成份对照品 杂质对照品 计算校正因子 供试品 供试品溶液 供试品的稀释液 对照品溶液 测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积 分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较 依法计算各杂质含量 优点准确度高 4 不加校正因子主成分自身对照法 供试品 供试品溶液 供试品的稀释液 对照品溶液 测定供试品溶液中各杂质峰面积 与对照溶液主成分峰面积比较 控制杂质的量 缺点检测波长处 各杂质和药物的吸收强度可能有差异 准确度差 优点不需杂质对照品 可同时控制各个杂质及其总量限度 5 面积归一化法 取一定量供试品溶液进样 测定各杂质的峰面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积 计算各杂质峰面积占总峰面积的百分率 应符合规定 优点不需杂质对照品 简便易行 缺点检测波长处 各杂质和药物的吸收强度可能有差异 控制杂质峰面积百分率不一定就是杂质限量 准确度差 3 在含量测定中的应用 1 外标法 2 内标法 96 75 测得两色谱峰的保留时间tR1 6 5min tR2 8 3min 峰宽W1 1 0min W2 1 4min 则两峰分离度R为A 0 22B 1 2C 2 5D 0 75E 1 5 99 135 HPLC法与GC法用于药物复方制剂的分析时 其系统适用性试验系指A 测定拖尾因子B 测定回收率C 测定保留体积D 测定分离度E 测定柱的理论板数 99m 91 95 相关方法为A 紫外分光光度法B 红外分光光度法C 气相色谱法D 高效液相色谱法E 荧光分光光度法91 由第一电子激发态的最低能级跃迁回基态的各个不同振动能级92 低能级的价电子吸收一定的能量后 跃迁到较高能级93 使用氢火焰离子化检测器94 分子中振动和转动能级的跃迁95 可以忽略流动相中的纵向扩散项 E A C B D 00 132 中国药典 2000年版 规定系统适用性试验应包括A 色谱柱的理论塔板数B 分离度C 重复性D 中间精密度E 拖尾因子 00 133 中国药典 2000年版 正文各品种项下规定的HPLC条件中 不得任意改变的是A 固定相种类B 固定相牌号C 流动相组成D 混合流动相各组分的比例E 检测器类型 01 80 用HPLC测得两组分的保留时间分别为8 0和10 0min 峰宽分别为2 8和3 2mm 记录纸速为5 0mm min 则两峰的分离度为A 3 4B 3 3C 4 0D 0 7E 6 8 01 121 125 以下情况所适用的方法A 高效液相色谱法B 气相色谱法C 两者均可D 两者均不可121 可用于测定药物的含量122 以气体为流动相123 以液体为流动相124 使用氢火焰离子化检测器125 不适用于热不稳定化合物的分析 C B A B B 01 140 色谱系统适用性试验的项目有A 拖尾因子B 理论板数C 检测限D 定量限E 分离度 例1 色谱法定量测定的方法有A 面积归一化法B 主成分自身对照法C 内标法D 外标法E 反相法 例2 色谱系统适用性试验一般包括A 测试色谱柱理论塔板数 n B 测量峰高C 测试分离度 R D 测试拖尾因子 T E 测定保留体积 例3 色谱系统适用性试验要求分离度A 应大于1 5B 应小于1 5C 应大于2 5D 应小于2 5E 应大于3 0 例4 中国药典 2000年版 规定 除另有规定外 色谱系统适用性试验中的拖尾因子 T 应在A 0 50 6 5B 6 5 7 5C 7 50 8 50D 8 50 9 50E 0 95 1 05 例5 色谱法鉴别被分离物各组分时 应该用A 峰高B 峰宽C 保留值D 分配系数E 塔板数 例6 衡量色谱系统好坏的参数是A 分散度B Rf值C 分离度D 保留时间E 斑点面积 例7 衡量色谱峰是否正常的参数应是A 校正因子B 峰宽C 峰高D 拖尾因子E 拖尾峰 例8 RP HPLC固定相与流动相极性关系是A 两者极性相同B 前者极性大于后者C 后者极性大于前者D 两者是同一液体E 两者均为惰性 例9 色谱峰高 或面积 可用于A 鉴别B 计算保留值C 含量测定D 测试被分离物的疗效E 判定被分离物组成 例10 HPLC检查药物中杂质的方法有A 面积归一化法B 加校正因子的主成分自身对照法C 不加校正因子的主成分自身对照法D 外标法E 内标法加校正因子测定法 例11 15A VisB IRC UVD pHE HPLC14 红外分光光度法15 可见分光光度法13 高效液相色谱法14 紫外分光光度法15 溶液酸碱度表示法 B A E C D 第三节电泳法 一 基本原理和方法在电场的作用下 带电颗粒向其所带电荷相反的电极方向移动 根据各组分淌度的不同而得到分离的方法 电渗的产生在电场的作用下 带正电的缓冲液整体向负极移动 淌度 单位电场强度下的电泳速度 电泳速度 带电颗粒在电场中的迁移速度 E 电场强度 各类电泳法 纸电泳法醋酸纤维素电泳法琼脂糖凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 二 毛细管电泳法以弹性石英毛细管为分离通道 高压直流电场为驱动力 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异实现分离的分析方法 毛细管电泳装置示意图 缓冲液 样品 缓冲液 毛细管电泳分离模式毛细管区带电泳 CZE 毛细管凝胶电泳 CGE 胶速电动毛细管色谱 MEKC 亲和毛细管电泳 ACE 毛细管电色谱 CEC 毛细管等电聚焦电泳 CIEF 毛细管等速电泳 CITP 96 72 电泳法是A 在电场下测量电流的一种分析方法B 在电场下测量电导的一种分析方法C 在电场下测量电量的一种分析方法D 在电场下分离供试品中不带电荷组分的一种方法E 在电场下分离供试品中带电荷组分的一种方法