染色法测细胞周期ppt课件

PI染色法测细胞周期 1 一 细胞DNA含量检测 细胞固定后用PI Propidiumiodide碘化丙啶 染色 因为PI特异性结合于细胞DNA 荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系 根据这个原理 可测出细胞的DNA含量 用于细胞周期 细胞倍体以及凋亡的检测 2 3 单参数直方图 图中2N代表G0 G1期细胞 4N代表G2 M期细胞 两者中间代表S期细胞 这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图 4 DNA细胞周期分析 细胞周期 G2 M G0 G1 s 200 400 600 800 1000 s DNA分析 DNA含量 细胞数量 5 6 2倍体 异倍体 4倍体 肿瘤组织中的各种DNA倍体 7 含量与凋亡关系 DNA亚G1峰的检测 利用PI染色 检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例 代表凋亡细胞数 凋亡过程中 细胞内核酸酶的释放 将DNA降解 分解成小的片段 在标本制备中的固定处理时 细胞膜的完整性被破坏 使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出 造成总体DNA含量减少 成为亚2倍体 8 9 10 2 凋亡研究 在G0 G1峰前出现一个亚二倍体峰 即凋亡峰 检测调亡 可进行抗肿瘤药物研究和某些因素对细胞的损伤机理的研究 11 12 AnnexinVAssay 13 图AnnexinV PI双标记分析细胞凋亡和坏死 14 Dateacquired 14 Jan 03File 7Gy4hr 001Source dongboDIPLOID 100 00 DipG0 G1 73 12 at48 16DipG2 M 9 59 at96 33DipS 17 29 G2 G1 2 00Dip CV 6 04Apoptosis 13 66 Mean 27 48 图FCM测试细胞周期分布和凋亡 15 根据凋亡细胞的特点来检测 在形态上 早期细胞核固缩 染色体边集在核膜内侧显新月体形 核碎裂 细胞浆和细胞器密度增高 细胞体积变小 细胞膜皱折卷曲 但早期细胞膜的完整性未受到破坏凋亡细胞的FSC SSC 细胞坏死时 细胞肿胀 FSC SSC 16 正常人静止体细胞有46条染色体 相当于7 10 12pgDNA 细胞核 我们称之为二倍体细胞 而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量 在细胞周期 G0 G1 S G2 M 的各个时期 DNA含量随各时相呈现出周期性的变化 在G1期 细胞开始RNA和蛋白质的合成 但DNA含量仍保持二倍体 17 进入S期后 DNA开始合成 这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间 当DNA复制结束成为4倍体时 细胞进入G2期 G2期细胞继续合成RNA及蛋白质 直到进入M期 因此 单纯从DNA含量无法区分G2期和M期 一旦有丝分裂发生 细胞分裂成两个子细胞 这两个子细胞或者进入下一个细胞周期 或者进入静止期 G0期 而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分 因此 整个复制周期可以描述为G0 G1 S G2 M期 18 19 通过核酸染料标记DNA 并由流式细胞仪进行分析 可以得到细胞各个时期的分布状态 计算出G0 G1 S及G2 M的百分含量 了解细胞的增殖能力 结合DNA指数分析 还可进行凋亡 异倍体等检测 20 G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 s DNAAnalysis DNAcontent Count NormalCellCycle 21 细胞浓度及质量要求 单细胞和核的上机浓度应约106 ml 浓度太低 上机时样本的流速不得不提高 这样就会影响检测的CV 浓度太高 则可能导致染料的相对不足 最终使染色不饱和 同样影响CV和检测结果 制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量 细胞是否聚集或过多的碎片 22 染料的选择取决于流式激光的配置 488nm的激光下应用PI 碘化丙啶 由于PI也与RNA结合 所以分析前样本应用Rnase处理 重要的是染料要足够 以保证饱和结合 PI的推荐浓度是至少20ug 106个细胞 其最佳浓度为50ug 106个细胞 23 操作步骤 取一瓶生长期的A549细胞 倒掉瓶中旧的培养液 加入3mlPBS 细胞生长面在下轻轻晃动细胞瓶 然后去掉液体 加入1ml胰蛋白酶消化1 5分钟 以镜下观察决定 加入5mlPBS轻轻吹打细胞生长面 制成细胞悬液 将细胞悬液移至15ml离心管中1500rpm离心5min 去上清 加入500ulPBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液 在旋涡状态下逐滴加入2ml 20 95 冷乙醇 混匀后固定30min 24 加入5mlPBS 1500rpm离心5min 去上清液 加入5mlPBS重悬细胞 1500rpm离心5min 去上清液 加入800ulPI染液 用枪轻轻吹打细胞团 混匀 室温避光染色30min上机检测 25 影响荧光染色的因素 温度 温度高于20 时 即出现温度淬灭 2 PH PI在7 2 7 6 保持荧光染料分子与溶剂间的电离平衡 3 荧光染料浓度 染料太少 结合不完全 染料过多 又会出现浓度淬灭现象 4 固定剂 醛类固定剂会干扰插入性染料与核酸分子的结合 造成荧光发射强度减弱 26