CRISPR_Cas9 基因编辑技术简介ppt课件

基因编辑技术CRISPR Cas9 1 1987年 日本大阪大学 OsakaUniversity 在对一种细菌编码的碱性磷酸酶基因进行研究时 发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段 但一直不清楚功能 后来的研究发现 这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中 2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列CRISPR Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats 2013年之后 研究者们在 science 和 nature 等国际著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR Cas9系统 并且已成功在人类 小鼠 斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰 1 CRISPR Cas系统概述 2 已测序的接近90 的古细菌和40 的细菌的基因组或是质粒中至少存在CRISPR基因座 根据Cas基因核心元件序列的不用 CRISPR Cas免疫体统分为3中类型 型 型和 型 型和 型CRISPR Cas免疫系统需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链 而 型CRISPR Cas9免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链 目前 型系统是被改造的最成功的人工核酸内切酶 1 CRISPR Cas系统概述 1 1CRISPR的分布与分类 3 CRISPR Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系统 通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别 利用Cas蛋白进行切割 从而达到对自身的免疫 1 2CRISPR系统获得 1 CRISPR Cas系统概述 4 2 CRISPR Cas系统结构 2 1CRISPR Cas主要由两部分组成 5 2 2CRISPR结构 CRISPR是一种特殊的DNA重复序列家族 广泛分布于细菌和古细菌基因组中 CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列 repeats 组成 重复序列的长度通常为21 48bp 重复序列之间被26 72bp间隔序列 spacer 隔开 CIRSPR通过这些间隔序列 spacer 与靶基因进行识别 2 CRISPR Cas系统结构 6 2 3Cas家族 Cas CRISPRassociated 存在于CRISPR位点附近 是一种双链DNA核酸酶 能在guideRNA引导下对靶位点进行切割 它与fokI酶功能类似 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用 2 CRISPR Cas系统结构 7 CRISPR基因座的表达 包括转录和转录后的成熟加工 当该噬菌体再次入侵细菌时 CRISPR簇首先转录为长的crRNA前体 然后逐步加工成小的成熟的crRNA CRISPR Cas系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰 crRNA结合相关的Cas蛋白后 形成crRNA Cas蛋白复合体 通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合 随后Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解 3 CRISPR Cas9系统作用机制 8 4 CRISPR Cas9系统 Type 因其简单性及可操作性 被改造成有力的基因工程工具 CRISPR Cas9 现在广泛使用的CRISPR Cas9系统来源于酿脓链球菌 TypeII系统具有以下特点 在CRISPR Cas基因座上游会表达tracrRNA tracrRNA会参与crRNA的加工 这个工程亦需要RNaseIII的参与 tracrRNA会与crRNA形成二聚体指导Cas对双链DNA的切割 9 Cas9是一种核酸内切酶 其具有 RuvC和HNH两个内切酶活性中心 Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能力 但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导 4 CRISPR Cas9系统 10 Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA链 使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性 随后的切割实验表明 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA 现在普遍使用的都是crRNA和全长tracrRNA融合体 简称sgRNA singleguideRNA 4 CRISPR Cas9系统 11 4 CRISPR Cas9系统 酿脓链球菌 12 4 CRISPR Cas9系统 13 CRISPRDesignTool http crispr mit edu E CRISPR http www e crisp org ZiFiT http zifit partners org Cas9Design Cas OFFinder CCTop http crispr cos uni heidelberg de 4 CRISPR Cas9系统 gRNA在线设计工具 14 4 CRISPR Cas9系统 15 基因敲除或者敲入 基因修复 基因调控 文库筛选 4 CRISPR Cas9系统 CRISPR Cas作用 16 5 CRISPR Cas9脱靶效应 2013年 研究者们发表多篇文章介绍CRISPR Cas9系统 但CRISPR Cas9目前仍存在一个很严重且无法避免的问题 即潜在的脱靶效应不可消除 CRISPR Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处10 12bp碱基的配对 而其余远离PAM处8 10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不大 Cas9蛋白不具特异性 17 沈彬 2015 6 降低脱靶效应 Cas9切口酶 通过点突变的方法 使Cas9只有单链切割活性 类似于切口酶 18 YuHisanoetal 2014 6 降低脱靶效应 添加同源臂 homologyarm HR 19 NicolasWyvekensetal 2015 FoKI dCas9 6 降低脱靶效应 20 FengZhangetal 2015 6 降低脱靶效应 CRISPR Cpf1系统 Cpf1系统更简单一些 它只需要一条RNA Cpf1酶也比标准SpCas9要小 使得它更易于传送至细胞和组织内 Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA Cas9切割留下 平端 bluntends Cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的 在裸露端留下了短悬端 overhang 这预计有助于精确插入 Cpf1切口远离识别位点 Cpf1IsaSingleRNA GuidedEndonucleaseofaClass2CRISPR CasSystem 21 7 视频 基因编辑CRISPR Cas9原理 22 thankyou 23