医学统计学第2版第四章抗体制药ppt课件

第四章抗体制药 2020 1 14 1 1 掌握 单克隆抗体的制备原理 方法及基本过程 单克隆抗体药物靶标的选择 基因工程抗体的类型 熟悉 噬菌体抗体库技术的原理和基本过程 单链抗体 双特异抗体的制备方法 转基因动物表达抗体的方法 了解 抗体药物的发展趋势 学习要求 2 第一节概述第二节单克隆抗体及其制备第三节基因工程抗体及其制备第四节噬菌体抗体库技术第五节转基因动物表达抗体第六节抗体治疗药物 2020 1 14 3 内容 3 第一节概述 一 基本概念 抗体 antibody Ab 指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白 免疫球蛋白 immunoglobulin Ig 具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白 Ig Ab 化学结构上的概念 生物学功能上的概念 2020 1 14 4 抗体工程制药 利用基因工程 细胞工程和转基因动植物技术生产抗体药物的过程 4 2020 1 14 5 5 免疫球蛋白 抗体 的基本结构 1 重链和轻链重链可分为 链 轻链可分为 型 抗体的类型由重链类型决定 上述重链分别对应了IgAIgDIgEIgGIgM2 可变区和恒定区重链和轻链N端第一个结构域为可变区 variableregion V区 轻链其余的1个及重链的3 4个结构域为恒定区 V区存在3个高变区也称互补决定区 complementarity determiningregion CDR1 3 及4个骨架区 frameworkregion FR1 4 三个高变区共同组成Ig的抗原识别部位 形成与抗原决定基互补的表位 6 2020 1 14 7 7 2020 1 14 8 多克隆抗体 病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质 对其产生的抗体也是多种抗体的混合物 称为多克隆抗体 单克隆抗体 针对一个抗原决定簇的抗体 又是单一的B淋巴细胞克隆产生的 高度特异 均一 来源稳定 可大量生产的抗体 多抗与单抗 8 传统抗血清 抗原 免疫 所有抗体混合 1 2 3 4 脾脏 淋巴結 B細胞 多克隆抗体制备过程 9 1 2 3 4 1 2 3 4 单抗 细胞融合 取出脾細胞 癌細胞 各抗体分开 单克隆抗体制备过程 10 疾病的诊断和治疗 诊断 检测与某些疾病相关的抗原 辅助临床诊断 临床治疗 如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体 对器官移植排斥反应有显著抑制作用 用作免疫抑制剂 作为载体制备导向药物 Antibodydrugconjugates ADC 治疗肿瘤 2020 1 14 11 抗体的应用 11 需解决的问题 鼠源性单克隆抗体的免疫原性 HAMA 完整的抗体分子分子量过大 难以穿透实体肿瘤组织 达不到有效的治疗浓度 延长半衰期 其他 2020 1 14 12 12 基本消除了单克隆抗体的鼠源性 免疫原性 鼠源氨基酸只占完整抗体分子的1 80 1 3 只保留同抗原特异性结合的活性 制备出改形抗体 单链抗体 单域抗体 最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位 2020 1 14 13 基因工程技术为解决问题提供了可能 13 二 抗体工程发展历程及趋势 1890年 Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素1937年 Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白 甲种 球蛋白 乙种 球蛋白 丙种 球蛋白 并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分 1975年 K hlerandMilstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出McAb 在临床上主要用于诊断和治疗 1976年 SusumuTouegava 利根川进 揭示了抗体多样性的遗传学基础 1984年报道了人 鼠嵌合抗体 多克隆抗体 单克隆抗体 基因工程抗体 2020 1 14 14 14 2020 1 14 15 整体水平抗体生成技术 细胞工程抗体生成技术 基因工程抗体生成技术 多克隆抗体 抗血清 单克隆抗体 嵌合抗体 改形抗体 小型化抗体 单链抗体 组合抗体库技术 噬菌体抗体库技术 Ig基因转基因小鼠 抗体真核表达技术 15 商业化的抗体药物 2020 1 14 16 16 FDA批准的抗体药物 全抗体37个 至2014 10月 抗体片段3个ADC3个 1个已撤市 双特异抗体2个Fc融合蛋白7个 17 18 2013年14个抗体药物销售过10亿美元 2020 1 14 19 110 2 65 6 87 76 83 86 75 67 51 19 生物药物专利悬崖 Pharmaceuticals2012 5 1393 1408生物技术药物研发热浪涌向中国 20 重磅化药销售 Pharmaceuticals2012 5 1393 1408 21 第二节单克隆抗体及其制备 2020 1 14 22 一 抗体分子的结构与功能二 单克隆抗体的制备 22 1 Fab段2个抗原结合片段fragmentwithantigenbinding 2 Fc段1个可结晶片段fragmentcrystallized Porter木瓜蛋白酶 1 F ab 2段1个结合颗粒性抗原出现凝集反应 2 Fc 段1个无生物学活性 Nisonoff胃蛋白酶 1 酶解片段 一 抗体分子的结构与功能 23 1 轻链 lightchain L链 214个氨基酸残基 24KD 分为 与 2个亚型 2 重链 heavychain H链 450 550个氨基酸残基 55 75KD 分为5类 链 IgM IgG IgA IgD IgE 2 重链和轻链 24 3 可变区和恒定区 1 可变区 Variableregion V区 L链N端1 2处 VL 110个aa H链N端1 5 1 4处 VH 118个aa HVR1 HVR2 HVR3又分别称为CDR1 CDR2 CDR3 2 恒定区 constantregion C区 L链C端1 2处 105个aa H链C端3 4 4 5处 331 431个aa 在同一种属动物中是比较恒定的 是制备第二抗体进行标记的重要基础 25 4 功能区 链内二硫键折叠成球形区称为功能区 约由110个aa组成 1 L链 2个 VL CL各1 2 H链 IgG IgA IgD 4个 V区1个 C区3个 IgM IgE 5个 V区1个 C区4个 3 功能区的作用 a VL和VH 结合抗原决定簇 FV区 b CL和CH 具有同种异型的遗传标记 c CH2 结合补体 d CH3 结合Fc受体单核细胞 巨噬细胞 粒细胞 B细胞 NK细胞 26 5 抗体基因结构 2020 1 14 27 人类编码Ig的基因分别位于不同的染色体重链 Heavychain 基因 位于14号染色体 轻链基因 链基因位于2号染色体 链基因位于22号染色体 每条肽链的编码基因可分为V区和C区两大部分 V区的基因是由不同的基因片段拼接而成的重链V区 由V D J片段拼接 轻链V区 由V J拼接 C区拼接决定了抗体的类别 27 胚系重链的基因结构 a 鼠 b 人 28 重链的VDJ重组 2020 1 14 29 29 轻链基因胚系及重排后结构 30 抗体类别转换 2020 1 14 31 31 V区功能 识别并特异性结合抗原C区功能 激活补体系统 抗体与抗原结合形成复合物可通过启动C1q激活补体经典途径及补体旁路途径 介导免疫细胞活性 抗体的调理作用 ADCC作用 介导超敏反应 穿过胎盘和黏膜 IgG是唯一能从母体通过胎盘屏障转运到胎儿体内的抗体 IgA合成的主要作用部位在黏膜 是黏膜局部抗感染的主要物质 2020 1 14 32 5 抗体的功能 32 2020 1 14 33 33 抗体功能 C区 ADCC 2020 1 14 34 34 抗体功能 C区 CDC 2020 1 14 35 IgG4 IgA IgE 35 二 单克隆抗体及其制备 2020 1 14 36 抗原与动物免疫细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养筛选阳性克隆与克隆化杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的纯化 36 单克隆抗体制备原理 37 37 单克隆抗体制备的基本技术 1 抗原与动物免疫抗原 颗粒性抗原和可溶性抗原 制备特定抗原的单克隆抗体 要制备用于免疫的适当抗原 再用抗原进行动物免疫 可以用化学合成 地高辛多数抗原物为混合物用整个肿瘤细胞做为免疫原 经过筛选 克隆化 制备出仅存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞上的表面标志分子的单克隆抗体 免疫动物 BALB c小鼠或Lou大鼠 目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB c小鼠和LOU大鼠 免疫方法 体内免疫和体外免疫 体外致敏淋巴细胞 38 体内免疫法 适用于免疫原性强 抗原量较多时应用 一般用8 12周龄雌性鼠 颗粒性抗原 细胞抗原 的免疫原性强 可不加佐剂 直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫 间隔1 3周 追加免疫1 2次 可溶性抗原 按10 100 g抗原 小鼠与福氏完全佐剂和灭活的分枝杆菌等量混合后注入腹腔内 进行初次免疫 间隔2 4周 再用不加佐剂原抗原追加免疫1 2次 一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原 刺激B细胞分裂 39 二 细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养基本方法 脾细胞 1 108 与骨髓瘤细胞 2 107 3 107 混合 在PEG作用下诱导融合 2min 用培养液将PEG融合液缓慢稀释 骨髓瘤细胞 SP2 0 P3 653 为缺陷性 PEG 分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂 常用浓度为40 50 相对分子质量4000为佳 为了提高融合率 在PEG溶液中加入DMSO 以提高细胞接触的紧密性 增加融合率 但必须严格限制接触时间 作用机理 诱导细胞膜上脂类物质结构重排 使细胞膜易打开而有助于细胞融合 40 细胞融合的步骤 将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2 1 10 1的比例混匀于50ml锥形离心管内200rpm离心7 10分钟 尽量吸净上清液 用手指轻击管壁 使管底沉淀的细胞铺展成薄层在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50 的PEG0 5ml 随后静置60秒再于5分钟内边振摇边逐滴加入5 10ml不含血清的培液或盐水缓冲液 以终止PEG的作用再静置10分钟 41 可生产有用抗体的淋巴細胞若与癌细胞融合 则形成稳定而可培养的细胞株 癌细胞可培养生长 浆细胞Bcell可分泌抗体 融合瘤Hybridoma 细胞融合 两组染色体混在一起 也可以培养生長产生专一性抗体 一個Bcell只产生一种抗体 42 细胞融合液中如何去除脾 瘤以外的融和细胞 解决方法 选择性培养基 HAT 43 HAT培养基筛选杂交瘤细胞 HAT是含一定浓度次黄嘌呤 H 氨基喋呤 A 及胸腺嘧啶核苷 T 的一种选择性培养基 其中三种成分与细胞DNA合成有关 44 m 核酸补救合成 m 核酸从头合成 核酸 氨甲喋呤 A 次黄嘌呤 H 胸苷 T TK HGPRT TK HGPRT 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶 叶酸拮抗物 45 2020 1 14 46 46 选择性培养方法 将融合的细胞悬浮于HAT的培养液 加入到96孔板内每2 3天换液一次 换液时吸去1 2 2 3培养液 加入等量的新鲜培养液 7天内 用HAT培养液 杀死瘤 瘤融合细胞后 第7 14天 改用HT培养液 14天以后 用普通的RPMI1640完全培养液 从融合后8 9天就可对所有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测 筛选出产生抗体的阳性克隆 47 大量细胞在HAT培养基中死亡 单个或少数杂交瘤细胞不易存活 解决办法 饲养细胞小鼠腹腔巨噬细胞 脾细胞 胸腺细胞最适的条件下 105个脾细胞形成1个杂交瘤细胞 大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡 单个或少数的杂交瘤细胞多半不能存活 加入饲养细胞才能使其繁殖 48 原因 饲养细胞能释放某些生长刺激因子能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞 故应用较多 49 三 筛选阳性克隆与克隆化 1 筛选阳性克隆 产生特定抗原的抗体产生细胞 占所有脾细胞的5 微量 快速 特异 敏感 简便 并一次能检测大批标本的方法 检测方法 免疫酶技术 免疫荧光技术 放射免疫技术 FACS 2020 1 14 50 50 ELISA 51 1 精制破伤风毒素抗原 吸附 约10 g ml 4 3h 洗涤 2 加杂交瘤培养上清液 4 1h 3 加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体 4 1h 洗涤 洗涤 4 加酶作用底物 呈色孔为阳性克隆孔 ELISA用于破伤风抗体的筛选 2020 1 14 52 52 2 克隆化 有限稀释法和软琼脂法应尽早克隆化 含不分泌细胞 多株分泌细胞 染色体易丢失克隆化 单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程 其中每个细胞的生物学特征和功能完全相同 一般3次克隆化 才能达到100 孔内均为抗体阳性细胞克隆 常用的克隆化方法有 有限稀释法 软琼脂法 流式细胞法 2020 1 14 53 53 有限稀释法 通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的 杂交瘤细胞悬液稀释 加入到96孔细胞培养板 使每个孔中在理论上只含有一个细胞 例 取出阳性孔内的细胞进行计数 用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞 如果在96孔板内每孔加0 1ml 其机率将为每孔内落入一个细胞 加入一定数量的饲养细胞 经过8 12天后 可观察到有集落生长的孔 据检测的阳性结果再次进行克隆化 2020 1 14 54 54 软琼脂法 培养液中加入0 5 左右的琼脂糖凝胶细胞分裂后形成小球样团块 用毛细吸管将小球吸出团块打碎后移入96孔板继续培养可吸出大量克隆细胞进行培养 因初代细胞很不易增殖 所以该法容易成功 2020 1 14 55 55 四 杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 一 杂交瘤细胞鉴定 鼠脾细胞染色体数 40 端着丝粒 小鼠骨髓瘤细胞染色体 SP2 0细胞为62 68 NS 1为54 64 中部和亚中部着丝点 杂交瘤细胞的染色体数目 亲本细胞数目总和 多数为端着丝粒 少数标志染色体 染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体 56 Ig类型 亚类测定 双扩法或ELISA法特异性测定 抗原类似物的交叉反应效价测定 用腹水或培养液的稀释度表示表位测定 竞争抑制法亲和性测定 测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体 秋水仙素裂解法McAb靶抗原分子量 常用westernblot 二 抗体性状鉴定 57 五 单克隆抗体的制备 1 体外培养法 可获得10 g ml的抗体 多采用RPMI1640培养液 添加10 20 胎牛或小牛血清 2 动物体内诱生法 可获得5 20mg ml的抗体 目前多采用 2020 1 14 58 58 体内诱生法 因为杂交瘤细胞的两种亲本细胞均来自BALB c小鼠 所以应选用BALB c小鼠来制备单克隆抗体 可于注入细胞的几周前 预先将具有刺激性的有机溶剂降植烷 pristane 注入腹腔内 以破坏腹腔内膜 建立杂交瘤易于增殖的环境 优点 操作简便 经济 所得单克隆抗体量较多且效价亦高 还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株 2020 1 14 59 59 小结 60 61 六 单克隆抗体的纯化 动物体内诱生法制备单克隆抗体具体纯化方法及过程1 澄清和沉淀处理离心1000g 5min 去除残留的小颗粒物质 小鼠腹水中含有红细胞 细胞碎块 纤维蛋白凝块及脂质等 0 2 m的微孔滤膜过滤 除掉污染的细菌 支原体和脂质 用饱和硫酸铵沉淀抗体 50 饱和硫酸铵能回收90 以上的单克隆抗体 2020 1 14 62 62 1 名词解释 抗体 免疫球蛋白 多克隆抗体 单克隆抗体2 单克隆抗体有哪些不足 如何改造 3 大量制备单克隆抗体的方法主要有哪些 4 制备单克隆抗体的一般流程是什么 如何制备杂交瘤细胞 思考题 2020 1 14 63 63 第三节基因工程抗体 基因工程抗体 Geneticengineeringantibody 根据研究者的意图 采用基因工程方法 在基因水平 对免疫球蛋白基因进行切割 拼接或修饰后导入受体细胞进行表达 产生新型抗体 目的 保留天然抗体的特异性和主要生物活性 去除或减少无关结构及鼠源单抗不足 赋予抗体分子新的生物活性 原理 抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区 V 同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区 C 64 内容 1 人 鼠嵌合抗体 ChimericAntibody 2 人源化改型抗体 HumanizedAntibody 3 单链抗体4 单域抗体与分子识别单位5 双功能抗体6 抗体融合蛋白 2020 1 14 65 65 基因工程抗体的类型 人 鼠嵌合抗体改型抗体 人源化抗体 FabFv单链抗体单域抗体最小识别单位抗体融合蛋白 2020 1 14 66 小分子抗体 66 1人一鼠嵌合抗体 ChimericAntibodies 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体 67 人 鼠嵌合抗体基因工程改造策略 构建嵌合抗体过程 鼠源单抗的可变区基因连到包含有人抗体恒定区基因并构建到表达所需的其它元件 如启动子 增强子 选择标记等 的表达载体上 在哺乳动物细胞 如骨髓瘤细胞 CHO细胞 中表达 68 鼠VH 鼠VL 人CL 人CH 抗体分泌细胞 人 鼠嵌合基因工程抗体 69 2人源化改型抗体 Reshapingantibody 鼠单克隆抗体V区的人源化 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多 但有时它仍可能引发较强的免疫反应 为了进一步降低抗体的鼠源成分 发展出CDR移植技术 CDR移植 即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内 所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体 也就是人源化抗体 humanizedantibody 70 经过CDR移植 抗体的免疫原性极低 而其抗原结合能力保持不变 结合半抗原及全抗原 如细胞表面受体 病毒等 的改形抗体都已有报道 到现在已有数百种人源化抗体 美国正式上市的28种治疗性单抗中多数是人源化抗体 71 人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法 全合成法是以人抗体序列为骨架 以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR 将整个可变区序列的两条链分解成若干片段 并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端 合成所有DNA片段 每组片段分别退火 然后逐组连接成完整的可变区基因 插入质粒中 进一步即可用于构建和表达改形抗体 72 定点突变法是将人的可变区基因克隆 根据鼠抗体的CDR序列合成几种突变引物 用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列 然后表达出改型抗体 研究表明 在构建改形抗体时 简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力 因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列 FR 进行操作 73 单链抗体 singlechainFv scFv P154 由一段弹性连接肽 linker 把可变区重链 VH 与轻链 VL 相连而成 具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位 连接肽的长度在10 15个氨基酸左右 具有一定弹性和蛋白酶抗性 常用的连接肽是 GGGGS 3它应具有柔软性 侧链少 抗原性弱等特点 3单链抗体 ScFv Fv由于其结合是非共价结合 故Fv不稳定 在VH与VL之间加上一段连接肽 把VH与VL连成一条单链 得到单链抗体 74 分子小 保持完整抗原结合位点 易进入组织 易于进行分子改造 融合毒素 酶 药物等构成双功能抗体 免疫原性低 可在大肠杆菌中表达 缺乏Fc段 不与非靶细胞 Fc受体阳性细胞 结合 易进入组织 偶联成像可用于诊断 体内半衰期短易从血循环中清除 亲和力和稳定性较完成抗体低 因只能与抗原结合 不能激活补体激活细胞免疫 CDC 及抗体依赖细胞毒效应 ADCC 2020 1 14 75 单链抗体 ScFv 特点 75 单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法 从杂交瘤细胞系构建单链抗体 可用PCR方法扩增可变区基因VH VL 将二者连接成ScFv基因 再组装到适当的表达载体上 ScFv的基因构建 76 单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌 有2种方式 一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白 但需进行变性复性 使其形成正确的立体结构 恢复抗体活性 二是分泌型表达 将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连 单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外 进行折叠后成为有活性的分子 重组ScFv的表达 77 双价及多价ScFv 2020 1 14 78 连接肽 linker 较短时 同一ScFv分子内VH与VL不能相互配对 分子间的VH VL功能区配对成一个二价的二聚体 也可构成三聚体或多聚体 78 抗体的VH VL约为完整分子的1 12 只由一个结构域构成 故称单域抗体 单域抗体尽管亲和力有所降低 但仍保持着原单抗的特异性 4 单域抗体和分子识别单位 VH 分子识别单位 约为完整分子的1 80 1 70大小 一般由一个CDR构成 它也保持着抗体的特异性 79 即双特异性抗体 bispecificantibody BSAb 是指能同时识别2种抗原的抗体 5 双 多 功能抗体 80 Hollinger等将 抗原抗体的轻链可变区基因 VLA 与抗 抗原抗体的重链可变区 VHB 通过短肽连接子连接 同样地 将VHA与VLB连接 将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中 构建成双链抗体的表达质粒 目前报道的表达质粒均为双顺反子 表达后 VLAVHB与VHAVLB交叉连结 形成双特异性抗体 81 双功能抗体实例能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞 将效应细胞富集在肿瘤周围 而且可以模拟天然配体的作用 与细胞表面引发分子结合 激活效应细胞 实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解 与既往肿瘤免疫治疗相比 除了能特异性识别肿瘤细胞外 还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处 从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强 发挥免疫导向作用 这是肿瘤治疗的新突破 82 Catumaxomab 2020 1 14 83 83 多功能抗体 84 6 抗体融合蛋白 将抗体片段 V区或C区 连接到与抗体无关的其他蛋白上 创造出抗体相关分子 称为抗体融合蛋白 antibodyfusionprotein 分类 Fv抗体融合蛋白 抗体的Fv与其他生物活性蛋白结合 主要用于导向治疗领域 Fc抗体融合蛋白 抗体Fc段与某些有黏附或结合功能的蛋白质融合而获得的融合蛋白 2020 1 14 85 85 Fv 抗体融合蛋白 抗体与毒素 酶 细胞因子等生物活性分子融合达到特异杀伤肿瘤细胞目的 抗体与毒素偶联 绿脓杆菌外毒素 蓖麻毒素 II期 抗体与酶蛋白融合 也称为抗体酶 abenzyme 前体药物疗法 ADEPT 抗体与细胞因子融合 IL 2 免疫介导疗法 2020 1 14 86 86 Fc 抗体融合蛋白 具有与特定蛋白 ProteinA ProteinG 结合的特点 便于检测与纯化 Fc介导的抗体效应功能 如 ADCC CDC及免疫调理作用 延长蛋白在血液中的半衰期 实例 CD4 Fc CTLA4 Fc TNFaR Fc VEGFR Fc VEGF TRAP 2020 1 14 87 87 2020 1 14 88 88 思考题 一 名词解释1 可变区2 恒定区3 互补决定区4 功能区5 人 鼠嵌合抗体6 改形抗体7 Fab抗体8 Fv抗体9 单链抗体 scFv 10 单域抗体11 双特异单链抗体 bisFvs 二 简答1 简述抗体的结构与功能 抗体多样性的遗传学基础 2 基因工程抗体有哪些类型 其特性有何不同 3 抗体融合蛋白有哪些类型 特征和设计策略是什么 试举例说明 4 多价抗体特点 2020 1 14 89 89 第四节噬菌体抗体库技术 抗体研究的三个阶段 以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表 其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体 以1975年K hler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表 以1994年Winter以基因工程方法制备抗体为代表 抗体研究领域的一次技术革命 完全用基因工程技术制备人源化抗体 还能利用基因转移和表达技术 通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体 在此基础上发展成抗体工程 Winter创建了噬菌体抗体库 Repertoireofantibodiesdisplayedonphages 技术 克服了人体不能随意免疫的缺点 用人外周血制备抗体文库 从而获得人源性基因工程抗体 90 将蛋白分子或多肽基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中 使噬菌体表面表达该异源分子 称为噬菌体展示 将B细胞全套可变区基因克隆 插入丝状噬菌体表达载体转化工程菌进行表达 在噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体 即为噬菌体抗体库 surfacedisplayantibodylibrary 噬菌体展示抗体库技术 91 用PCR扩增人抗体重链可变区 VH 和轻链可变区 VL 基因 获取目的基因 克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面 载体构建 用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增 淘筛和鉴定 使抗体基因以分泌的方式表达 筛选可溶性的抗体片段 抗体库 组合抗体文库 在建库过程中如果将VH和VL随机组合人天然抗体库 抗体mRNA来源于未经免疫的正常人 一 基本原理和程序 92 噬菌体抗体库 93 丝状噬菌体基因 94 95 96 噬菌体表面展示文库技术的要点 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游 随机克隆入相应载体形成组合文库 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段 97 用固相化抗原经 亲和结合一洗脱一扩增 数个循环直接 方便 简捷 高效地筛选出表达特异性好 亲和力强的抗体噬菌体库 使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内 形成游离的抗体片段 经过纯化即可获得目的抗体 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后 转入大肠杆菌 98 1 获取目的基因 提取RNA 经RT PCR获取抗体某一特定基因区段 2 抗体库技术的载体 普遍使用噬菌粒 phagemid 载体 3 淘筛 panning 用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛 淘汰非目的克隆 使目的克隆大量扩增 4 表达与鉴定 目的克隆经过鉴定后 再导入感受态菌珠 进行可溶性表达 其产物用Westernblot分析确定后 就完成了全过程 噬菌体抗体库技术的基本方法小结 99 二 噬菌体抗体库技术的特点 1 模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过1011库容 所以能包含B细胞全部克隆 建库的外源基因来自人体外周血 骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增 这是人体多克隆细胞的总mRNA 使用的通用引物采自多个人体 具有人的种属普遍性 抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性 100 2 避开了人工免疫和杂交瘤技术由于抗体库的大容量和极高的筛选效率 使得可以调出任意抗体基因 用基因工程方法制备抗体 因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术 3 可获得高亲和力的人源抗体在噬菌体抗体库技术中 VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程 所用的抗体基因又来自人体 因此 所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体 101 将抗体的基因型和表型紧密联系起来 可绕过杂交瘤技术 不需要复杂的基因工程技术 抗体基因筛选的范围广 技术稳定 可靠 生产周期短 可规模化生产 适用范围广 既可用于抗体制备 也适用于其它蛋白如激素 酶 药物 随机多肽等的生产 该项技术的优点 102 噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性 它简单易行 筛选容量大 效率高 绕过了细胞融合及免疫等步骤 而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程 从而在实际应用上具有很大意义 使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面 利用亲和层析 两轮富集达106倍 该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革 103 第六节抗体治疗药物 自第一个抗体药物批准上市以来 已被成功用于治疗肿瘤 自身免疫疾病等多种 疑难杂症 截止2012年6月 美国FDA批准28种抗体药物 抗肿瘤占53 8 免疫性疾病 19 2 器官移植11 5 感染性疾病7 7 心血管疾病3 8 其他3 8 104 商业化的抗体药物 2020 1 14 105 5个靶标的抗体仿制药开发是热点 CD20 HER2 EGFR VEGF TNF alpha 105 2020 1 14 106 VEGFTarget Anti VEGFStrategy 106 HER2signalingpathwayandAnti HER2Strategy 107 Combinationstrategiestopotentiatecellularresponseandovercomeresistance NancyE HynesandHeidiA Lane ERBBreceptorsandcancer thecomplexityoftargetedinhibitors NatRevCancer 2005 5 341 354 108 109 2013年14个抗体药物销售过10亿美元 2020 1 14 110 110 2 65 6 87 76 83 86 75 67 51 110 抗体药物分类 抗体或抗体片段 小分子抗体药物 抗体融合蛋白抗体偶联物或免疫偶联物 2020 1 14 111 抗体与放射性同位素偶联抗体与抗癌化学药物偶联抗体与免疫毒素偶联 111 一 放射性同位素标记的抗体治疗药物 抗体作为放射性同位素的导向载体 体内应用较成功 同位素标记抗体操作简便 用量小 可观测药物在体分布和药物动力学 治疗起步阶段 人体研究较少 初步结果证明放射性同位素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大 同位素来源困难 防护和污染问题 112 1 常用的抗癌药物氨甲喋呤 MTX 阿霉素 ADM 丝裂霉素 MMC 环磷酰胺 CTX 新抑癌蛋白 NCS 正定霉素 DOX 抗体药物偶联物提高体外细胞毒性 对化学疗法耐药的细胞株仍有效 二 抗癌药物偶联的抗体药物 113 抗体 药物偶联体由三个部分组成靶向单克隆抗体稳定的连接子高活性小分子药物抗体 药物偶联体是一类新型的肿瘤治疗药物靶向治疗 结合单抗的靶向作用和小分子药物的高活性 选择性杀伤肿瘤细胞 从而提高疗效 减少副作用个体化治疗 诊断 治疗一体化组合治疗 内外兼攻 二石一鸟 有效的克服癌症治疗的病灶转移和抗药性难题 Jaraczetal BioorgMedChem 2005 13 5043 5054 Wuetal NatBiotechnol 2005 23 1137 1146 Ricartetal NatClinPractOncol 2007 4 245 255 Junutulaetal NatBiotechnol 2008 26 925 932 什么是抗体 药物偶联体 Antibody drugconjugateADC ADC 第三届抗体药物高峰会 2013年6月20 22日 广州 ADC是如何工作的 1 2 3 4 ADCbindingtoreceptorReceptor mediatedinternalizationtoendosome 3 Traffickingtolysosome thenantibodydegraded Freedrugreleased andthenreachtarget recycling Endosome Lysosome 第三届抗体药物高峰会 2013年6月20 22日 广州 Table1 ApprovedandlatestageADCsindevelopment 第三届抗体药物高峰会 2013年6月20 22日 广州 116 免疫毒素及其换代制品在导向药物中 毒素和抗体的交联物称为免疫毒素 第三代免疫毒素 重组免疫毒素 用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗体基因进行重组表达 特异性好 稳定性强 渗透性佳 免疫源性低 可大量制备 三 免疫毒素偶联的抗体药物 117 思考题 1 噬菌体抗体库技术的特点 2 简述噬菌体抗体库技术的基本方法和特点 3 抗体治疗药物有哪些 并举例说明 抗体药物调研报告 1 药品基本信息 治疗靶标及适应症 基本结构 开发公司 上市 临床开始研究时间等 2 靶标结构及致病机理3 药物分子结构 属于抗体类那种结构形式4 药物的临床前药效 药代 安全性结果及结论5 药物临床研究结果 I III期结果 2020 1 14 118 118