药品微生物限度与无菌检查ppt课件

药品微生物限度与无菌检查 风险管理风险调查 评估 微生物实验室技术能力 药品微生物控制 风险管理 风险调查 评估 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 药品微生物检验的过程控制 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 有效的方法 方法验证 SOP操作 有效的结果 可靠的结论 结果判断 过程控制 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 药品微生物检验的过程控制 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 有效的方法 方法验证 SOP操作 有效的结果 可靠的结论 结果判断 无菌检查用隔离系统验证指导原则 药品微生物实验室质量管理指导原则 药品洁净实验室微生物检测和控制指导原则 微生物鉴定指导原则 药品微生物检验替代方法验证指导原则 对照培养基 alInstitutesforFoodandDrugControl 案例 阳性结果与玻璃安瓿表面采样菌高度相似 Nation LuzhouInstitutesforFoodandDr 无菌检查过程微生物控制 空气微生物浮游菌沉降菌 表面微生物样品包装表面操作人员手部 易折方式影响折断力色环 通过在瓶颈喷涂与玻璃膨胀系数不同的色釉产生应力 从而使断面平整 灌装工艺落后造成折断力差为防止灌装中安瓿断头安瓿折断后 断面应平整LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl国家药用包装容器 材料 标准YBB00332002 点刻痕易折玻璃安瓿 点刻痕易折安瓿的色点应标记在刻痕的上方中心与中心线的偏差不得过 1 0mm 刻痕工艺控制不好深浅 长短 高低位置不一色点和刻痕位置偏离 规格尺寸不规范瓶身外径精度不够刻痕不易控制瓶颈壁厚不均匀折断后断面不平整 玻璃材质不佳低硼硅玻璃 48 6 中性硼硅玻璃 7 7 我国90 以上低硼硅玻璃 玻璃安瓿表面消毒方案比较 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 杀孢子剂 过氧乙酸 喷洒后立即 3min 5min 10min 用75 乙醇钝化 再用湿棉签擦拭取样 酒精灯过火1秒钟 3秒钟 5秒钟 10秒钟 后直接用湿棉签擦拭取样 微生物检验的过程控制 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 有效的方法 方法验证 SOP操作 有效的结果 可靠的结论 结果判断 过程控制 微生物实验室工作流程 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 环境保障 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl WHOGPML各区域等级 微生物限度 无菌检查环境要求 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 无菌检查 环境洁净度B级背景下的局部A级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中 B Aor隔离系统 中国药典2010版 万级下的百级 中国药典2015版 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则无菌检查用隔离系统验证指导原则 9205 9206 微生物限度检查 受控洁净环境下的局部洁净度不低于B级的单向流空气区域内 D BSC 生物安全柜 洁净室 台工作原理 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 层流Laminarflow 混流Conventional mixedflow cleanroom LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 相关洁净标准比较 ISO14644讨论了洁净室和受控环境的设计与建设按ISO14644的分类是建立在环境中每单位体积的总体粒子数的基础上 分类不区分非生物粒子或生物粒子 相关洁净标准比较 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 2010版GMP洁净度级别标准 静态 百级 动态 万级 相关洁净标准比较 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 2015版建议的洁净实验室环境监测频次及项目 按ISO14644的定级是建立在环境中每单位体积的总体粒子数的基础上 定级不区分非生物粒子或生物粒子 LuzhouInstitutesforFoodandDrugC B级 与 C级 的异同 ontrol 悬浮粒子与环境微生物 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 非生物粒子数量和活的微生物浓度之间的关系在科学上未达成绝对的一致 当操作人员是粒子的来源时 以下的结论是成立的 即洁净室中的粒子越少 空气中微生物存在的可能性就越小 实验设备运行时大量产生的粒子污染和人员产生的粒子污染之间是无法明确区分的 大量的药物除了微生物以外还有粒子限度的要求 几乎肯定的是 部分悬浮粒子与微生物有关 因此 洁净室监测应包括微生物与粒子数两方面 洁净室使用次数与浮游菌数关系 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 416 浮游菌数201月2月3月4月5月6月7月8月9月10月11月12月 6 8 10 161412 13 使用次数 13 浮游菌数 16 使用次数 近8年无菌室C级浮游菌高限图 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 9080706050403020100 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 7月8月9月 硬件差异 软件差异 洁净区微生物监测水平 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl USP35 15cfu信息性 非标准性 监控基于风险评估 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 120100806040200 法规标准OOT行动限OOE警戒限常规波动 WHOgoodpracticesforpharmaceuticalmicrobiologylaboratoriesAppendix4Examplesofequipmentqualificationandmonitoring 环境微生物归属 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl LuzhouIns titutesforFoodandDrugControl 欣弗事件 欣弗培养物 洁净环境常见菌 头状葡萄球菌 Staphylococcuscapitis 溶血葡萄球菌 Staphylococcushaemolyticus 缓症链球菌 Streptococcusmitis 科氏葡萄球菌 Staphylococcuscohnii 藤黄微球菌 Micrococcusluteus 山羊葡萄球菌 Staphylococcuscaprae 肺炎克雷伯 巨大芽孢杆菌 粘质沙雷菌 夺命的欣弗 不同生物安全水平对设施的要求 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 不同保护类型及生物安全柜的选择 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl I级安全柜适用于一级 二级和三级安全实验室 II级和III级安全柜则适用于所有级别安全实验室 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl ClassI生物安全柜 适用于样品不需保护的工作1 从前窗口吸入的负压气流 用以保护人员的安全 2 排出的气流经HEPA过滤器过滤 用以保护环境 不受污染 3 对受试样本 不能提供切实可靠的保护 无外接风道有外接风道ContaminatedairundernegativepressureContaminatedairunderpositivepressureHEPA filteredairRoomairLuzhouInstitutesforFoodandDrugControl II级A2型生物安全柜 前窗进风气流平均流速 0 50m s 生物安全柜排风管道接口与建筑物排风系统相连接 可以从事少量的的挥发性有毒化学物质或放射性的工作 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 在生物安全柜上工作 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 干净的物品 工作台摆放 被污染的区域 废弃物托盘 垃圾袋 无菌隔离系统与传统洁净技术的对比 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl Na 隔离器 2x3 gloveIsotest H2O2溶液被泵入蒸发器液态H2O2 气态H2O2 10SAL表面杀灭效率 6 tionalInstitutesforFoodandDrugControl 隔离器 9206无菌检查用隔离系统验证指导原则 1 操作验证3 灭菌验证4 灭菌循环验证 2 完整性验证 5 内部洁净度验证6 仪器仪表验证 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl LuzhouInstitutesfor FoodandDrugControl 三种主要设备比较 微生物检验的过程控制 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 有效的方法 方法验证 SOP操作 有效的结果 可靠的结论 结果判断 过程控制 ChP无菌检查培养基与USP BP的比较 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 硫乙醇酸盐流体培养基 FluidThioglycollateMedium ChP无菌检查培养基与USP BP的比较 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 大豆胰酪胨培养基 TSB 改良马丁培养基 微生物实验室常用菌株 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 铜绿假单胞菌 Pseudomonasaeruginosa CMCC B 10104 大肠埃希菌 Escherichiacoli CMCC B 44102 金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus CMCC B 26003 生孢梭菌 Clostridiumsporogenes CMCC B 64941 枯草芽孢杆菌 Bacillussubtilis G 芽孢杆菌 CMCC B 63501 G 杆菌 G 球菌 酵母菌 霉菌 兼性需氧菌 专性厌氧菌 专性需氧菌 白色念珠菌 Candidaalbicans CMCC F 98001 黑曲霉 Aspergillusniger CMCC F 98003 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 在硫乙中生长差异 仅在厌氧层生长 需氧层厌氧层均生长 铜绿假单胞菌 Pseudomonasaeruginosa 仅在需氧层生长 CMCC B 10104 大肠埃希菌 Escherichiacoli CMCC B 44102 金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus CMCC B 26003 生孢梭菌 Clostridiumsporogenes CMCC B 64941 枯草芽孢杆菌 Bacillussubtilis CMCC B 63501 方法适用性内容修订 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 微生物计数定义变化 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 对照培养基 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 培养基质量控制 USP 之前验证过的中国药典 对照培养基 单剂量免称量独立包装专利号 ZL200920108836 8 回收率 待测培养基平均菌落数 cfu 100 对照培养基平均菌落数 cfu 50 200 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 培养基适用性检查 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 培养基适用性检查 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 培养基适用性检查 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 培养基适用性检查 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 培养基适用性检查 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 样品 乌鸡白凤丸 乌鸡白凤丸 胰酪大豆胨琼脂培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 疑似菌落做革兰染色革兰阳性杆菌不属于霉菌或酵母菌 将无菌硫酸庆大霉素 相当于20mg庆大霉素 胰酪胨大豆琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基 LuzhouInstitutesforFoodandD rugControl 选择性培养基适用性 LuzhouInstitutesforFoodandD rugControl 选择性培养基适用性 微生物检验的过程控制 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 有效的方法 方法验证 SOP操作 有效的结果 可靠的结论 结果判断 过程控制 检测方法验证 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 标准 药典 检测方法实验室在进行常规检测前应证明该实验室可以满足标准检测方法中的某些性能指标 即方法确认 并证明某一方法适用于某产品的检测 方法适用性包括阳性对照和阴性对照 新建方法方法验证与方法适用性 药典方法 其他成熟方法 方法转移与方法确认 部分菌株的验证 有案可查 溯源性 建立实验室自身的方法依据体系其他准确度 精密度 专属性 检测限 定量限 线性 粗放性 验证的一般程序与环节 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 需前处理 不需前处理 无抑菌作用 样品 检查 验证前处理方法对污染菌生长 检出的影响 验证抑菌活性去除的有效性 以及去除方法对污染菌生长 检出的影响 可以通过验证实验判断 药品微生物检查方法验证的一般程序与环节 利用供试品与微生物的差异 降低或消除供试品的影响通过模拟实验对降低或消除效果加以检验 吐温80结构 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 乳化剂降低了混合体系中各组分的界面张力 并在微滴表面形成较坚固的薄膜由于乳化剂给出的电荷而在微滴表面形成双电层 阻止微滴彼此聚集 而保持均匀的乳状液 分装5份9 9ml供试液 0 1ml金黄色葡萄球菌液 0 1ml金黄色葡萄球菌液 0 1ml金黄色葡萄球菌液 0 1ml铜绿假单胞菌液 0 1ml枯草芽孢杆菌液 0 1ml白色念珠菌液 0 01m 1lm黑l黑曲曲霉霉菌菌液液 0 1ml铜绿假单胞菌液 0 1ml金黄色葡萄球菌液 0 1ml铜绿假单胞菌液 0 1ml枯草芽孢杆菌液 0 1ml金黄色葡萄球菌液 0 1ml铜绿假单胞菌液 00 1 1mml白l白色色念念珠珠菌菌液液 00 11mmll枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌液液 00 1 m1mll金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌液液 00 11mmll铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌液液 根据供试品的理化特性与生物学特性 采取适宜的方法制备合适的供试液 稀释度依据样品特性 质量标准制定 计数方法适用性试验 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 保证平皿中的菌数不大于100cfu 微生物检验的过程控制 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 有效的方法 方法验证 SOP操作 有效的结果 可靠的结论 结果判断 过程控制 微生物限度案例 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 某板蓝根冲剂 标准为细菌数不得过1000cfu g 某药检所细菌数结论1200cfu g 送中检院仲裁 1 方法适用性 合格 不合格 LuzhouInstitute DrugControl 菌种传代保藏流程 1BioBall3推荐方式2自动稀释 sforFoodand LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 试验用菌株的传代次数不得超过5代 从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代 代的定义 每接种一次即为一代 有在新鲜的培养基上生长过程 传代示意图 干燥菌种 0代 QC CV1CV2CV3液体培养基复苏 1代 工作菌株传代保藏规程 菌种传代流程 S1S2 S3 QC S1 S2 S3 第二代工作菌悬液 冷藏 零下20 cv1CV cv2 cv3 cv4 QC Cycle1第一代储备管冻存 零下30或70 冻干菌种 第二代工作菌斜面冷藏 2 8 鉴别 cv11 cv2 cv3 cv36 Cycle2第二代储备管冻存 零下30或70 QC TSB QC 工作菌株传代保藏流程示意图 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 微生物检验的过程控制 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 有效的方法 方法验证 SOP操作 有效的结果 可靠的结论 结果判断 过程控制 实验操作 物料进场 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 消毒液搽拭物品外表面 洁净传递 风淋 紫外照射 核心区外围消毒剂清洁外表面 双层无菌包装 外围 实验操作 人员进场 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 一更 二更 LuzhouInstitutesfor FoodandDrugControl 硫乙阴性090423 马丁阴性090423 马丁 样品090423 硫乙 样品090423 马丁 阳性090423 硫乙 阳性090423 监控平板 样品沉降菌手指 无菌检验框架示意图 LuzhouInstitutesfor 无菌三针单联管 FoodandDrugControl 实验过程监控 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 表面监控 手部监控环境菌监控 无菌程序保障 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 无菌检查样品前处理分批消毒 实验 混合 统一消毒 统一实验 严格遵守外表面消毒程序一般环境酚类 phenylphenol tertiaryamylphenol 洁净环境过氧乙酸 75 乙醇 无菌级 苯式苯酚 三级戊基苯酚 增加过程监控力度表面菌采样 手部采样 每批 动态浮游菌采样 下风口 LuzhouInstitutesfor Fooda ndDrugControl 明确标识 Paperlabelsarepreferredovermarkerpens 原始记录 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 样品信息 方法信息 仪器信息 状态检验结论前置方便核验 校对 复核信息前置 原始记录 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 样品信息一致材料信息 试剂信息 检验方法描述 检验结果记录 原始记录 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 样品信息一致过程监控信息包括监控方案培养条件培养结果及培养基信息 是否启动偏差调查记录 原始记录 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 样品信息环境保障调查仪器运转环境监控检验操作调查培养基 检验用具阴性 阳性对照操作细节 结果判断调查 微生物检验的过程控制 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 环境保证 培养基保证 无菌性检查 灵敏度检查 有效的方法 方法验证 SOP操作 有效的结果 可靠的结论 结果判断 过程控制 结果判断 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 阳性 阴性 供试品管浑浊 即判不合格除非能充分证明试验结果无效 即生长的微生物非供试品所含 设备 环境的微生物监控结果超标 回顾实验过程 发现污染因素 鉴定微生物 确认是操作引入的 无菌试验经确认无效 可重试 药品无菌检验的溯源性分析 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 药品微生物实验室 环境 过程微生物的监测 药品的微生物检测 环境 过程细菌与药品细菌的比较 结论 产品污染 实验污染 污染源排除 重试 溯源分析 整改 药品微生物实验 环境微生物的监测 药品的微生物检测 环境微生物与阳性结果的比较 结论 保证药品微生物检验结果可靠的有效途径 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 过程微生物信息的全面性 微生物鉴定结果的准确性 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 各类常见微生物的菌落特征 微生物类别菌落特征 单细胞微生物 菌丝状微生物 细菌 酵母菌 放线菌 霉菌 主要特征 细胞 形态特征 小而均匀 个别有芽孢 大而分化 细而均匀 粗而分化 相互关系 单个分散或按一定方式排列 单个分散或假丝状 丝状交织 丝状交织 菌落 含水情况 很湿或较湿 较湿 干燥或较干燥 干燥 外观特征 小而突起或大而平坦 大而突起 小而紧密 大而疏松或大而致密 参考特征 细胞生长速度 一般很快 较快 慢 一般较快 气味 一般有臭味 多带酒香 常有泥腥味 霉味 革兰染色 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl FoodandDrugControl 第一步 结晶紫使菌体着上紫色第二步 碘和结晶紫形成脂溶性大分子复合物 分子大 能被细胞壁阻留在细胞内 第三步 酒精脱色 细胞壁成分和构造不同 出现不同的反应 第四步 番红复染 增加脱色菌与背景的反差并区别于未脱色菌 G 菌 细胞壁厚 肽聚糖网状分子形成一种透性障 当乙醇脱色时 肽聚糖脱水而孔障缩小 故保留结晶紫 碘复合物在细胞膜上 呈紫色 G 菌 肽聚糖层薄 交联松散 乙醇脱色不能使其结构收缩 其脂含量高 乙醇将脂溶解 缝隙加大 结晶紫 碘复合物溶出细胞壁 番红复染后呈红色 革兰染色原理 LuzhouInstitutesfor 实验室常用细菌革兰染色结果 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl G 芽孢杆菌代表菌种 枯草杆菌 Bacillussubtilis G 球菌代表菌种 金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus KOH拉丝试验 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 原理 革兰阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂 释放出未断裂的DNA螺旋 使氢氧化钾菌悬液呈现粘性 可用接种环搅拌后拉出粘丝来 而革兰阳性细菌在稀碱溶液中没有上述变化 方法 取1滴40g L氢氧化钾水溶液 应新鲜配制 于洁净玻片上 取新鲜菌落少许 与氢氧化钾水溶液搅拌混匀 并每隔几秒钟上提接种环 观察能否拉出粘丝 用接种环拉出粘丝者为阳性 仍为混悬液者为阴性 主要用于革兰阴性菌与易脱色的革兰阳性菌的鉴别 大多数革兰阴性菌于5 10s内出现阳性反应 有的则需30 45s 假单胞菌 无色杆菌 黄杆菌 产碱杆菌 莫拉菌等大多数在10s内呈阳性 不动杆菌 莫拉菌反应较慢 大多数菌株在60s内出现阳性 而革兰阳性菌在60s以后仍为阴性 细菌鉴定技术 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 营养物质代谢试验 碳源和氮源利用试验 各种酶类试验API试验条 各种自动鉴定系统 表型鉴定 16SrRNA分型 核糖体分型 脉冲场电泳 基因型鉴定 傅里叶变换红外技术 色谱光谱 表观生物学活性 核酸物质 全细胞信息 细菌的鉴定流程 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 基因型鉴定的局限性 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 鉴定系统同样不能鉴定所有的微生物 需要昂贵的分析设备及耗材 通常仅有关键的微生物调查才会应用 仅凭基因型数据作出的决定 对于考虑微生物特征 测试历史及微生物来源 是没有意义的 当今伯杰氏手册中的分类学手段基于遗传物质并非遵循表观水平 导致一些已知的微生物分类学发生改变及重命名 黑曲霉ATCC16404 药品微生物实验室微生物鉴定宗旨 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 通过整合 使用多层面的信息 如微生物特征确定 表型及基因型数据 及微生物来源 将多相分类学的概念应用于微生物鉴定 建立内部数据库 忠实记录鉴定结论 无论哪种方式 在确认过程中 应根据供应商或药典的建议 使用适当的质控菌株 总结 药品微生物检查的过程控制环境保障培养基保障操作保障 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 针对微生物结果的溯源性调查过程微生物信息的全面性微生物鉴定结果的准确性 LuzhouInstitutesforFoodandDrugControl 谢谢各位同仁各位朋友各位领导 有问题可以加QQ讨论 12673859