信号转导研究方法ppt课件

信号转导通路研究策略和常用方法 搞懂信号通路查找文献 了解信号系统的研究进展和热点找到研究点 1 功能分析 表达分析 如何分析信号蛋白 何时何地表达基因过表达 或基因沉默 细胞水平和整体水平 相互作用蛋白立体论证 2 基因水平转录水平转录后加工翻译水平翻译后加工mRNA和蛋白质降解 蛋白质基因表达可以在不同层次上调节 3 基因表达分析方法 启动子分析 EMSA Reportergeneassay CHIPassay NuclearRun onassay DNAFoot printingassay DNAtruncationandsite directedmutagenesis翻译水平分析 WesternBlots ImmunocytochemistryImmunohistochemistry Proteinmodification Proteomics 转录水平分析 RT PCR RealTimePCR Insituhybridization Northernblots RNaseprotectionassay Primerextentionassay比较转录组学 Differentialscreening Subtractivehybridization Differentialdisplay Array basedmethods 4 1 蛋白质表达水平和细胞内定位研究信号蛋白分子表达水平检测 Westernblotanalysis ELISAProteomics信号蛋白分子在细胞内定位研究 Immunohistochemistry ImmunocytochemistryImmunofluorescence IF Greenfluorescentprotein GFP fusionprotein typically livecells 5 印迹技术blotting 将在凝胶中分离的生物大分子转移到固相化介质上 并加以检测分析的技术 应用 DNA RNA 蛋白质的检测 DNA印迹 SouthernblottingRNA印迹 Northernblotting蛋白质印迹 Westernblotting 6 又称蛋白质印迹技术或免疫印迹技术 蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移 电转 至膜性支持物上 NC膜 再与溶液中的抗体相互结合的技术 主要用于检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质化学修饰 磷酸化 以及蛋白质分子间的相互作用研究等 Westernblotting 7 8 9 Electrophoresis 10 转膜 Protein HRP DABH2O2 1Ab 2Ab 抽提细胞蛋白 定量聚丙烯酰胺凝胶电泳 与特异性抗体杂交 根据标记物特点显色 11 硝酸纤维素膜 目的蛋白质 抗目的蛋白一抗 标记的二抗 偶联的碱性磷酸酶 磷酸化生色体系 脱磷酸显色 采用Westernblot方法检测蛋白质原理示意图 12 应用举例 某药物是否可引起目的蛋白的表达变化 上调或下调 分别抽提细胞蛋白 未处理 药物处理 定量相同质量上样 聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹 电转移 杂交 抗体 显色 显影根据显影结果判断 内参 目标蛋白 检测标本很多的情况下Western无法满足高通量的需求 13 ELISA Phosphospecific ELISAs EnzymeLinkedImmunosorbentAssay 检测蛋白质表达量或者活性状态 化学修饰 磷酸化 比westernblot更快速 更高效 14 蛋白质组 proteome 一个基因组所表达的全部蛋白质 蛋白质组学 proteomics 研究细胞 组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学 蛋白质组学 Proteomics 同一基因组在不同细胞 不同组织中的表达情况各不相同 在空间和时间上呈动态变化 15 蛋白质组学研究技术平台 高效率 高通量 双向电泳分离样品蛋白质蛋白质点的定位和切取质谱分析 16 第一向 等电聚焦电泳 IEF 17 第二向 SDS PAGE电泳 18 19 免疫荧光技术Immunofluorescence IF 利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针 然后与被测抗原或配体发生特异性结合 形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光 因此利用荧光显微镜可对抗原进行定性或定位检测 采用流式细胞免疫荧光技术 FCM 可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子 用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体 可在同一细胞内同时检测两种不同的分子 DoubleIF 也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测 20 2 蛋白质与蛋白质相互作用研究技术 Co IP 免疫共沉淀 withantibodyagainstoneproteinfollowedbyWesternblotwithantibodyagainstanotherproteinGSTpull downassayYeasttwo hybridassayFRET fluorescenceresonanceenergytransfer assay 21 agarosebead IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的 proteinA G 能特异结合免疫球蛋白FC片段的现象而发展的方法 目前多用精制的proteinA G预先结合固化在agarosebeads上 使之与含有抗原的溶液及抗体反应后 beads上的proreinA G就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的 proteinA 抗原 抗体 22 Y 裂解细胞免疫沉淀蛋白质X 免疫共沉淀 Co IP 技术 非变性条件下裂解时 完整细胞内存在的许多蛋白质 蛋白质间的相互作用被保留了下来 若用蛋白质X的抗体免疫沉淀X 那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来 进一步进行WesternBlot和质谱分析 常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合 也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档 缺点 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质相互作用 23 WesternBlot和质谱分析 24 Co IP工作示意图 Co immunoprecipitation binding wash elution 25 GST融合蛋白进行Pulldown实验 GSTpull downassay原理将GST融合蛋白 taggedprotein 标记蛋白 orthebait 饵蛋白 GST His6 Flag biotin 作为探针 与溶液中的特异性搭档蛋白 testprotein orprey被扑获蛋白 结合 然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白 一般在发现抗体干扰蛋白质 蛋白质之间的相互作用时 可以启用GST沉降技术 该方法只是用于确定体外的相互作用 26 GST PulldownAssay 27 转录激活因子 DNA结合结构域 BD 转录激活结构域 AD 酵母双杂交技术 酵母双杂交技术是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相互作用的简便而有效的研究方法 在酵母细胞中分析蛋白质相互作用 以真核细胞转录激活因子的结构为基础 28 将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体 诱饵 bait 将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体 猎物 或靶蛋白preyortargetprotein 当两个杂交体共转化酵母细胞 此酵母细胞含有上游有DNA结合位点的报告基因 若X和Y没有相互作用 则单独不能激活报告基因的转录 若X和Y可相互作用 则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子 激活报告基因的转录 因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用 但限于核内表达的蛋白质的相互作用 酵母双杂交系统 29 30 荧光共振能量转移 FRET 是对生物大分子之间相互作用定性 定量检测的一种有效方法 是在活体细胞中实时地对生物大分子之间的相互作用进行动态监测 两个携带不同荧光基团 如GFP YFP CFP等 的大分子在相互间距离足够近时会发生激发态能量非放射性地由一个荧光基团 供体 向另一个荧光基团 受体 转移的现象 如果发生FRET 则供体信号将淬灭而受体信号将激活或增强 FRET检测系统可以快速高效地捕获来自标定分子间相互作用的短暂微弱的荧光信号 而以分子尺度分辨出供体 受体的平均距离 并能显示出受体 供体的相互作用 蛋白质直接相互作用的荧光共振能量转移FluorescenceResonanceEnergyTransfer 31 以光线激发后 供体荧光基团 ECFP X 会将激发能量转移至距离10 100 以内的受体荧光基团 EGFP Y 使之发出荧光 通过检测受体荧光基团激发的荧光即可确认两蛋白质间的相互作用 ECFP 强化型蓝荧光蛋白 EGFP 强化型绿荧光蛋白 FRET 32 3 磷酸化蛋白质研究方法 Westernblotwithphospho specificantibodies ELISAPhosphopeptideandphosphoaminoacidanalysisbymassspectrophotometricanalysis 激酶活性的测定信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化 因而对这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义 常见激酶活性的测定有PTK PKC及PI 3K等 均有商品化的试剂盒 33 4 基因转录活性检测信号蛋白转录水平表达 mRNA 的检测 RT PCR RealtimeRT PCRNorthernblotanalysis genechip tomeasurechangesingeneexpressionatlargerscales 基因启动子 增强子转录活性的检测 Transientorstablereporterassay luciferase Luc 34 RT PCR 35 RT 以polyT为引物 在逆转录酶催化下cDNA合成PCR 特异引物进行目的DNA的扩增 应用 1 获得目的基因 编码蛋白 2 比较不同条件下mRNA变化 RT PCR 36 Real timePCR 用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析 荧光染料 每形成一个DNA双链 就有一定数量的染料结合上去 染料一结合就产生荧光信号 信号强度与DNA分子总数目成正比 37 TaqMan探针 寡核苷酸探针的5 端标记一个荧光报告基团 reporter 3 端标记一个荧光淬灭基团 quencher 38 报告荧光基团与淬灭基团分离 荧光共振能量转移不再发生 报告基团发绿色荧光 当激发光照射到探针时 被激发的报告基团将能量转移给附近的淬灭基团而不发光 39 每产生一条DNA链 就切断一条探针 每切断一条探针 就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 40 5 蛋白质与DNA相互作用的研究技术 Gelshift orelectrophoreticmobilityshift assay EMSA typically withsmallerDNAsizes Chromatin immunoprecipitation ChIP assay toassessoccupancyofDNAsiteswithspecificfactorsinlivingcells 41 42 Gelshift 43 染色质免疫沉淀技术 chromatinimmunoprecipitationassay CHIP 体内分析蛋白质 DNA相互作用 真核生物基因组DNA以染色质的形式存在 因此 研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径 CHIP的基本原理 在活细胞状态下固定蛋白质 DNA复合物 并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段 然后免疫沉淀此复合体 特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段 通过对目的片断的纯化与检测 从而获得体内蛋白质与DNA相互作用的信息 44 45 6 基因或蛋白质功能研究改变基因结构基因突变 点突变 缺失 融合等 将突变基因或蛋白引入细胞以检测其功能 Dominantnegativemutants 缺失结构域突变体 Ligand bindingsitePhosphorylationsiteDockingsiteProtein proteinbindingsiteDNAbindingsite 46 基因表达或蛋白质活性的抑制 观察表型变化推测基因功能RNAi useofsmallinterferingRNA siRNA toreducespecificmRNAlevels AntisenseoligonucleotidesRibozymeMonoclonalAntibodySmallinhibitormolecules tyrosinekinaseinhibitor TKi 在生物整体内改变基因表达或基因结构 转基因技术 transgenicKnock out 47 RNA干扰技术RNAInterference RNAi 由双链RNA所引起的序列特异性基因沉默 48 长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的 核酸酶切成 个碱基对的短双链RNA 称为小干扰RNA小干扰RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体 称为RNA诱导沉默复合体 该复合体可识别与小干扰RNA有同源序列的 RNA 并在特异位点将该 RNA切断 49 RNAi实例 载体法 查找靶基因mRNA利用网络在线支持 寻找siRNA序列根据查找的siRNA序列 合成长链oligo构建载体转染检测效应 包括干扰效应和生物学效应 50 转基因 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中 导入基因的表达可引起生物体性状可遗传的改变 称之为转基因 转基因动物 以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物 转基因技术transgenictechnology 51 转基因动物模型实验步骤 转基因载体的构建 将转基因载体导入受精卵细胞或胚胎干细胞 将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫内 对转基因动物进行鉴定 52 转基因载体 结构基因 报告基因 增强子 启动子 受精 全能性细胞 注射 植入 假孕小鼠 后代 Southernblot RT PCR Westernblot 转基因小鼠 53 基因敲除技术GeneKnock out 54 体外合成无效基因或突变基因 定向插入 同源重组 宿主细胞染色体DNA中取代相应正常基因 使特定目的基因在细胞内或生物体内失活 应用转基因方法孵育出转基因动物 即为基因敲除动物 基因敲除技术GeneKnock out 55 信号转导中第二信使含量的测定第二信使含量的高低同信号传递密切相关 1 Ca2 的测定 原子光谱法 离子微电极测定法 放射示踪法及标记示踪法等 目前常用标记示踪法 即用荧光探针标记靶细胞 常用的荧光探针有quin 2 Am Fura 2 Am及Indo 1等 后二者较为敏感 2 IP3的测定 采用3H TdR标记的肌醇标记靶细胞后 用不同的刺激剂刺激细胞 分离磷脂酰肌醇混合物 通过阴离子交换层析柱分离洗脱 收集IP3洗脱峰后进行液闪测定 此外 还可以使用Amersham公司生产的D myo IP3 3H 分析系统直接测定粗提物中的IP3含量 此方法简易 敏感 3 DAG的测定 首先提取含DAG的样品 用DAG激酶催化底物DAG 使之发生磷酸化 外源加入32 ATP 最后将反应产物进行分离后测定放射性含量 根据标准品计算出样品中DAG的含量 4 cAMP的测定 1 cAMP 3H 分析系统 其优点是放射性半衰期长 可用于大量样品的分析 2 cAMP 125I 分析系统 用于小量样品的分析 3 cAMPELISA测定方法 此方法简便 敏感 56 例如检测组织或细胞中某个信号通路及其作用 1 样本 组织 细胞 2 免疫组化 免疫细胞化学定位3 RT PCR RealtimePCR Westernblot检测通路关键信号分子的表达 mRNA水平 蛋白水平 磷酸化状态 4 检测通路相互作用蛋白 CoIP等 6 关键信号分子基因沉默或增强 沉默 抑制剂 siRNA 抗体 基因敲除动物 增强 激动剂 构建过表达载体转染 7 芯片 组学检测 信号通路研究基本策略 57 例如研究某药物对细胞的作用及相关信号通路 1 药物刺激细胞 时间梯度 浓度梯度 2 检测药物对细胞的作用 毒性 增殖 凋亡 侵袭 迁移等 3 共聚焦显微镜定位 4 RT PCR RealtimePCR Westernblot检测通路关键信号分子的表达 mRNA水平 蛋白水平 磷酸化状态 5 检测通路相互作用蛋白 CoIP FRET等 6 关键信号分子基因沉默 抑制剂 siRNA 抗体 后检测7 芯片 组学检测 谢谢 信号通路研究基本策略 58 基因功能研究策略 新发现的功能未知的基因 通过生物信息学分析对该基因所编码蛋白质的空间结构及功能进行预测 应用分子生物学技术在细胞及动物水平进行研究 蛋白表达 细胞定位 沉默或过表达对细胞功能的影响等 通过探讨与该基因蛋白相互作用的蛋白而确定新基因的功能 蛋白质结构域分析和结构测定 59