人群维生素D筛查方法

ICS 11.020C 55WS中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准WS/T 人群维生素 D 筛查方法Screening Method of Vitamin D in Population 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识文稿版次选择- - 发布 - - 实施中 华 人 民 共 和 国 国 家 卫 生 健 康 委 员 会 发 布WS/T I前 言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与健康所、宁波市疾病预防控制中心、深圳市计量质量检测研究院、深圳市慢性病防治中心、中粮营养健康研究院、南京医科大学（待定）。本标准主要起草人：（待定）。WS/T 1人群维生素 D 筛查方法1 范围本标准规定了人群维生素D营养状况筛查的方法。本标准适用于血清/血浆中25-羟基维生素D 的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。WS/T 225 临床化学检验血液标本的收集与处理。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 25-羟基维生素 D 25-Hydroxyvitamin D；25(OH) D25-羟基维生素D是血中维生素D的主要存在形式，占体内维生素D 95%以上，25(OH)D半衰期较长，因此，血清25(OH)D水平能较好地反映体内维生素D的营养状况。主要包括两种形式：25(OH) D2、25(OH) D 3。25-羟基维生素D 2 25-Hydroxyvitamin D2：由麦角钙化醇经一级羟化后生成， 又称25-羟基维生素D2。25-羟基维生素D 3 25-Hydroxyvitamin D3：由胆钙化醇经一级羟化后生成，又称25-羟基维生素D 3，主要来源于阳光照射，在体内合成25-羟基维生素D 3，是血液中维生素 D的主要存在形式。4 样品的采集及保存4.1 取血4.1.1 血液标本的采集:静脉血。取血方法见 WS /T 225。4.1.2 本法使用血清（血浆），血清（血浆）可分装。4.1.3 每管血清/血浆量200L。WS/T 24.2 血清（血浆）保存标本于 2 8 可稳定 7 天，-20 可稳定 12 个月。若标本不能及时检测，建议于-70存放标本，仅一次冻融。5 测定方法5.1 酶联免疫法5.1.1 原理样本中25羟基维生素D与羊25(OH)D抗体形成复合生物素，通过洗液除去非结合物，再加入酶标记的抗原或抗体，此时，能固定下来的酶量与样品中被检物质的量相关。通过加入与酶反应的底物显色后，根据颜色的深浅可以分析样品中25羟基总维生素D的含量。5.1.2 仪器和材料5.1.2.1 恒温培养箱、酶标仪、洗板机；5.1.2.2 25-羟基总维生素 D 检测试剂盒（酶联免疫法）5.1.3 分析步骤5.1.3.1 按血清（血浆）25 羟基总维生素 D 酶联免疫试剂盒使用说明准备仪器、标准品、质控品、试剂等。5.1.3.2 血清（血浆）标本应达到室温，混合均匀后进行测定，确保样品杯中无气泡。为了防止液体挥发影响结果，所有样品、标准品、质控品上机后都应在 2 小时内测定。5.1.3.2 严格按仪器和试剂盒操作说明要求进行标准品、质控品及样品的测定，并读取、保存和计算检验结果。5.2 化学发光免疫法5.2.1 原理将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于 25-羟基总维生素 D 的检测分析技术，包括直接化学发光免疫法、间接化学发光免疫法和电化学发光免疫法。直接化学发光免疫法是以化学物质，如异鲁米诺、吖啶酯等直接标记抗原或抗体，免疫反应后，直接引发化学发光反应进行定量检测。间接化学发光免疫法是用某些工具酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记抗原，在免疫反应的终点用鲁米诺等发光体系测定发光强度，从而确定标记结合抗原的量。WS/T 3电化学发光免疫法是指在电极上施加一定的波形电压或电流信号，进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。5.2.2 仪器和材料5.2.2.1 化学发光免疫分析仪5.2.2.2 25-羟基总维生素 D 检测试剂盒（化学发光免疫法）5.2.2.3 光路检测剂5.2.3 分析步骤5.2.4.1 按化学发光免疫分析仪器操作说明和试剂盒使用说明，准备仪器、试剂、标准品和质控品等。5.2.4.2 进行化学发光免疫分析仪系统测试以及 25-羟基总维生素 D 检测试剂盒定标。5.2.4.3 血清（血浆）标本应达到室温，混合均匀后进行测定，确保样品杯中无气泡。为了防止液体挥发影响结果，所有样品、标准品、质控品上机后都应在 2 小时内测定。5.2.4.4 严格按仪器操作说明要求进行标准品、质控品及样品的测定，并读取和保存检验结果。5.3 LC-MS/MS 法5.3.1 原理血清（血浆）中的 25-羟基维生素 D2 和 25-羟基维生素 D3 经甲醇/乙腈沉淀蛋白后，采用正己烷萃取，用氮气吹干后复溶并定容，使用高效液相色谱分离，串联质谱多反应监测模式（MRM）检测，同位素内标法定量，该方法可以较好地分离 25-羟基维生素 D2、25-羟基维生素 D3。5.3.2 试剂和溶液除非特殊注明，本标准所有试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中三级用水规定，色谱用水符合GB/T6682中一级用水规定，溶液按照 GB/T 603配制。5.3.2.1 试剂25-羟基维生素D 2标准品（C 28H44O2，CAS ：21343-40-8）：纯度98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。25-羟基维生素D 3标准品（C 27H44O2，CAS ：19356-17-3）：纯度98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。甲醇（CH 3OH）：LC/MS级。正己烷（C 6H14）：LC/MS级。甲酸（HCOOH）：LC/MS级。牛血清白蛋白（BSA）：纯度 98%。WS/T 4氮气（N 2）：纯度99.9%。甲酸-水溶液：0.1%。甲酸-甲醇溶液：0.1%。乙腈（CH 3CN）：LC/MS级。BSA牛血清白蛋白溶液：1%。沉淀剂，甲醇：乙腈（1：1，v/v ）。标准储备溶液（10 g/mL）。同位素内标标准储备溶液（10 g/mL）标准系列溶液：5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL 和500 ng/mL，用甲醇配制。混合同位素内标溶液：100 ng/mL，用甲醇配制。5.3.2.2 仪器和设备分析天平，感量：0.0001g。分析天平，感量：0.00001g。高效液相色谱-串联质谱联用仪。氮吹仪。离心机：离心力12000 g。旋涡混合器。移液枪或移液器。5.3.3 分析步骤5.3.3.1 标准系列工作溶液制备取7个1.5 mL离心管，分别加入180 L 空白替代血清样品（ 1%BSA牛血清白蛋白溶液），以及20 L标准系列溶液（5.3.2.1），旋涡振荡30 s。此标准系列工作溶液中的25-羟基维生素D 2、25-羟基维生素D 3浓度均为0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.5 ng/mL、5.0 ng/mL 、12.5 ng/mL、25.0 ng/mL 和50.0 ng/mL。5.3.3.2提取和净化在标准系列工作溶液中分别加入20L 混合同位素内标溶液，涡旋振荡30 s。加入400 L沉淀剂（甲醇/乙腈=50+50 ，V/V），室温下涡旋振荡混匀30 s；加入1.2 mL正己烷，室温下涡旋振荡5 min，然后在4 和离心力大于 12000 g下离心5 min；吸取1.0 mL上清液至1.5 mL离心管中，室温下用氮气吹至干；用100 L初始流动相复溶，涡旋振荡30 s，继续在4 和离心力大于12000 g下离心5 min，上清液转移至进样瓶中待LC-MS/MS分析。5.3.3.3 样品制备取血清（血浆）样品200 L至1.5 mL离心管中，加入20 L 混合同位素内标溶液，涡旋振荡30 s。以下操作同5.3.3.2。WS/T 55.3.3.4 高效液相色谱-串联质谱联用仪参数设置液相色谱分析参考条件：色谱柱：C18柱（柱长100 mm，柱内径2.1 mm，填料粒径 1.7 m)；流动相：A相：含0.1 % 甲酸的水溶液；B 相：含0.1 % 甲酸的甲醇溶液；梯度洗脱：85%97%B（0 min2.0 min），97%B（2.0 min3.5 min），97%85%B（3.50 min3.51 min），85%B（3.51 min7.0 min）；流速：0.30 mL/min；柱温：40 ；进样体积：20 L。注：应用此方法，25-羟基维生素 D2和25-羟基维生素D3基本可达基线分离。质谱测定参考条件：电离方式：电喷雾电离，正离子模式，ESI+；检测方式：多反应监测模式（MRM）；气帘气：35 psi；喷雾电压：4000 V；去溶剂气温度：450 ；雾化气：50 psi；去溶剂气：50 psi。MRM离子对参数见表1所示。表 1、母离子、子离子、去簇电压和碰撞能量目标化合物 母离子/(m/z) 子离子/(m/z) DP/eV CE/eV25-羟基维生素 D2 413.2 355.2*，337.1 90，90 15，152H3-25-羟基维生素 D2 416.2 358.2*，340.1 95，95 36，1525-羟基维生素 D3 401.2 257.2*，365.3 100，100 19，222H3-25-羟基维生素 D3 404.2 257.2*，368.3 100，100 19，20*定量离子5.3.4.5 定性测定在同一色/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时间与标准溶液中检出的色谱峰的保留时间一致，所选择的离子对的质荷比也一致，而且样品溶液中定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准溶液中的定性离子对的相对丰度比较，相对偏差也不超过表2规定的范围，则可判定样品溶液中存在该物质，标准溶液的多反应监测离子图（MRM）见有附录A。WS/T 6表 2、定性离子对相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度 50% 20%50% 10%20% 10%允许相对偏差 20% 25% 30% 50%5.3.4.6 标准工作曲线的制作在5.4和5.5的液相色谱和串联质谱分析条件下，将5.3.3.1和5.3.3.2得到的标准系列工作溶液由低浓度到高浓度进行进样分析，以25-羟基维生素D 2和25-羟基维生素D 3色谱峰与其对应的同位素内标色谱峰的峰面积比值-浓度比值作图，得到标准系列工作溶液的直线拟合方程，其线性相关系数应大于0.99。5.3.4.7 样品测定在5.3.3.4的液相色谱和串联质谱分析参考条件下，将5.3.3.3得到的待测样品溶液进样分析，按内标法计算待测试样溶液中目标物的质量浓度。待测试样溶液中的目标物的质量浓度应在标准工作曲线的线性范围内，超过线性范围则应适当减少取样量后再重复测定。5.3.4.8 空白试验以1%BSA牛血清白蛋白溶液代替血清（血浆）样品，按5.3.3.3的步骤做空白试验。5.3.4 分析结果的计算5.3.4.1 标准工作曲线的拟合对25-羟基维生素D 2和25-羟基维生素D 3以及同位素标记D3-25-羟基维生素D 2和D3-25-羟基维生素D3按表1分别提取MRM图，积分得各自的峰面积。以标准品定量离子峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，以标准物质浓度与内标物浓度的比值为横坐标进行标准工作曲线的拟合，按式（1）得到标准工作曲线参数a和 b值。 （1）bCaAISstdISstd式中：Astd 标准系列工作溶液中目标物的定量离子MRM积分峰面积；AIS 标准系列工作溶液中内标物的定量离子MRM积分峰面积；Cstd标准系列工作溶液中目标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL ）；CIS标准系列工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL ）；a 标准工作曲线的斜率；b 标准工作曲线的截距。5.3.4.2 结果计算WS/T 7血清（血浆）样品中25-羟基维生素 D2和25-羟基维生素D3的质量浓度按式（2）计算：（2）)(argargbACISetISet 式中：Ctarget 血清（血浆）样品中目标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL ）；CIS 血清（血浆）样品中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL ）；Atarget 血清（血浆）样品中目标物的定量离子MRM积分峰面积；AIS 血清（血浆）样品中内标物的定量离子MRM积分峰面积；a 6.1得到的标准工作曲线斜率；b 6.1得到的标准工作曲线截距。注：结果用平行测定的算术平均值表示，保留小数后一位。WS/T 8附录 A（资料性附录）图 1 25-羟基维生素 D2 和 25-羟基维生素 D3 标准溶液 MRM 图（C18 柱）