体外分析技术PPT课件

,体外分析技术,定义,以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。,待测物质浓度与检测手段,临床化学分析,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fertility Hormone,Allergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,常量,微量,超微量,体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点。,发展,1956年Berson和他的同事们偶然地观察到131I标记的胰岛素与胰岛素抗体的结合与体系中存在的非标记胰岛素的量呈一定的相关关系，而建立了放射免疫分析法，对医学的发展起到了划时代的推动作用，于1977年获得诺贝尔医学奖。 几乎是在同一时期，Ekins和Murphy用自然存在在血液里的激素结合球蛋白（hormone-binding globulins）建立了竞争性蛋白结合分析方法(competitive protein binding assays, CPBA)，测定甲状腺素(T4)和皮质激素。,近年来的主要优势包括多种技术的互相渗透，自动化程度的提高等。例如将酶免疫分析技术与荧光技术或化学发光技术结合，建立的荧光酶免疫分析及化学发光酶免疫分析，可极大地提高灵敏度，增大检测范围。 在时间分辨荧光免疫分析( TRFIA)等分析法中应用新技术实现多个待测物同时检测。,结合反应动力学规律 遵守可逆反应的质量作用定律： k1, v1 R+L RL k2, v2,方法学基础,放射性测量技术酶定量技术化学发光定量技术荧光定量技术,定量手段 (标记配体作为示踪剂),特异性结合反应：抗原-抗体的免疫结合反应；配基-受体的结合反应；底物-催化酶之间的酶促反应； 结合体：抗原-抗体；激素-激素结合球蛋白；受体-配体；,生物学基础,体外分析技术,体外放射分析,体外非放射分析,放射性竞争结合分析,放射性非竞争结合分析,放射免疫分析 (radioimmunoassay, RIA),免疫放射分析,酶免疫分析,化学发光免疫分析,荧光免疫分析,(immunoradiometric assay, IRMA),(EIA),(CLIA),(FIA),分类:,放射免疫分析 radioimmunoassay, RIA,一、RIA的基本原理,（一）竞争抑制结合反应：放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标记抗原（Ag）与定量的标记抗原（*Ag）对限量的特异性抗体（Ab）的竞争抑制结合反应。,基本原理,Ag-Ab + Ag,*Ag,Ab,Ag,+,+,*Ag-Ab + *Ag,(B),(F),*Ag与Ag 免疫活性相同 *AgAg Ab,Ag= * Ag , AgAb=*AgAb,Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag(F),Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag (F),Ag,*Ag,Ab,*AgAb,AgAb,*Ag,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,Ag,（二）剂量反应曲线：标准曲线,标记物与被测物之间的函数关系可以用剂量反应曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列标准抗原反应而绘制出来的，所以又叫标准曲线。 标准抗原(标准品)是厂家在试剂盒中提供的已知剂量的非标记抗原。,标准曲线的绘制方法,用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在一定条件下同限量的特异性抗体进行反应； 在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和F； 分别测量B和F的放射性； 用反应变量（如B/F）作为纵坐标，反应剂量作为横坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是剂量反应曲线。,Ag,25,50,100,200,400,800,*Ag,Ab,分离B、F,B%=B/(B+F),F%=F/(B+F),R=B/F,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,浓度,B%,标 准 曲 线,未知样品的测量,在同等条件下，用待测抗原与一定量的标记抗原与限量特异性抗体发生反应，并用同样的方法分离待测抗原的B和F，测量其放射性，计算出B/F，在剂量反应曲线上就可以查出对应的抗原浓度。,Ag,25,50,100,200,400,800,*Ag,Ab,分离B、F,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,B%,？,B%,F%,B/F,Calibration Curve,60,优缺点比较,1、放射免疫分析技术,放射免疫技术是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的一类免疫测定技术。放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。,1、放射免疫分析技术,优点：超微量分析技术，具有很高的精密度、灵敏度和准确度 缺点：反应条件要求一般，但该技术所用试剂具有放射性，对人体有一定的危害，实验人员应加强防护。同时试剂存在半衰期，试剂必须在半衰期内用完，否则试剂会作废，这需要科学地做好试剂计划。另外反应过程中抗原的含量低到一定程度时会出现不确定因素，使灵敏度受到限制。,2、酶标记免疫分析技术,是用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体分子，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术，酶联免疫吸附分析法（ELISA）现在被广泛应用于实验诊断中。 原理：在抗体分子上连接酶分子，进行夹心法免疫反应，反应结束后，将结合的复合物和游离抗体分开，取结合部分，利用酶的催化活性，由结合部分上的酶将特定的底物转化为特定的颜色，利用分光光度计测定，颜色的深浅与酶的量呈正比，而酶的量又和复合物的量呈正比，由此给出复合物的量。 常用的酶是辣根过氧化物酶 常用的底物是四甲基联苯胺,2、酶标记免疫分析技术,优点：普通的分光光度计就可以工作，仪器的灵敏度较放免仪有所降低，但酶分子可形成大量有色产物，会对灵敏度有所补偿。因此ELISA 法也具有很高的灵敏度。同时本方法没有应用放射线，避免了放射线对人员的危害。 缺点：可能会出现“倒钩”现象，使实验出现假阴性或抗原、抗体的实际含量减低。另外，ELISA 法实验是一次性的，显色反应往往需要在一定时间内读数，无法重复测量。,3、时间分辨荧光免疫分析技术,原理：待测物通过免疫反应形成的复合物上带有镧系元素（常用铕元素）。铕元素经紫外线激发后会发出长波荧光。在免疫反应结束后需向反应体系中加入一个“荧光增强剂”，提高荧光强度。上述激发可以反复激发，这就大大增强信号强度。反应过程直到荧光衰减到很低水平，停止记录。荧光强度与待测物的浓度相关，通过计算机数据处理系统可以给出待测物的浓度。 标记物：由镧系元素通过一定的连接剂与抗体蛋白相连而组成。,3、时间分辨荧光免疫分析技术,优点：信号强，测量时间短，具有较高灵敏度。 缺点：标记物和荧光增强剂制备难度大，且荧光增强剂含一定有毒物质，废物应该严格处理。,4、化学发光免疫分析技术,免疫化学发光分析技术 （chemiluminescence immunoassay，CLIA） 化学发光酶免疫分析技术 （chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA） 电化学发光免疫分析技术 （electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）,4、化学发光免疫分析技术,免疫化学发光分析技术用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂和pH纠正液成为碱性环境，吖啶酯即可在不需要催化剂的情况下分解、发光 。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。,4、化学发光免疫分析技术,发光,Y,Y,Y,磁微粒,被测抗原,+,抗体,+,带丫啶酯标记物抗体,冲洗后,（1） 加入H2O2 （pH10）,（2） 加入碱 （pH10）,4、化学发光免疫分析技术,化学发光酶免疫分析技术用参与催化某一化学发光反应的酶来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。标记物 发光剂 辣根过氧化物酶（HRP） 鲁米诺碱性磷酸酶 AMPPD,辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图,碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图,4、化学发光免疫分析技术,电化学发光免疫分析技术以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。,电化学发光免疫分析示意图,4、化学发光免疫分析技术,相比于其他标记免疫技术的优势： 1.灵敏度高，特异性强：可实现ng甚至pg级微量待检物质的定量检测，单克隆技术的完善为检测的特异性提供了良好的保证。 2.线性范围宽：可满足103106数量级内的绝对定量检测需要，保证了临床应用中的简便性，避免了实验中的稀释误差。 3.标记物稳定，试剂有效期长：商业化的化学发光免疫中的标记物稳定，试剂一般均可达1年以上的有效期。 4.自动化程度高，检测菜单齐全：方便临床应用，大大提高了临床检测的稳定性。,几种标记/检测技术灵敏度的比较,酶标,荧光,放免,发光,灵敏度(mol/L),10-1810-1510-1210-9,几种标记/检测技术线性范围的比较,酶标,荧光,放免,发光,线性范围,105104103102,几种标记/检测试剂的有效期比较,酶标,荧光,放免,发光,有效期（月）,1815129630,三种免疫测定技术的成本及费用,三种免疫测定技术的成本及费用,放免,酶标,发光,临床应用,（一）肿瘤标志物及其临床意义,理想的肿瘤标志物,特异性100% 灵敏度100% 器官特异性 与肿瘤大小或分期有关 能进行疗效观察 与预后有关 可靠的预测价值,肿瘤的发生发展,正常组织细胞-间变-恶性变（肿瘤细胞）-不可见前期（3mm,肿瘤标志物异常）-可见前期（3mm，影像学异常）,肿瘤的发展及诊断期,肿瘤标志物在全球的应用情况,肿瘤标志物的分类（化学特性）,癌胚抗原类标志物 糖类抗原标记物 酶类标志物 激素类标志物 癌基因 其他,肿瘤与肿瘤标记物,相同的肿瘤可能检测出多种不同的肿瘤标记物 相同的肿瘤标记物可能出现在不同的粘蛋白上 CA19-9和CA50已经在不同的粘蛋白核心上得到鉴定: MUC-1,MUC-3。（Baeckstrom et al, 1992和1995） 涎腺蛋白。（Baeckstrom et al,1995） 颌下腺粘蛋白 支气管肺泡粘蛋白,不同的肿瘤标记物可能出现在相同的粘蛋白上 在肿瘤细胞株中CA199,CA50和CA242共同表达于 MUC-1和诞腺蛋白中。（Baeckstrom et al, 1992）,肿瘤标志物基本上不能对肿瘤定位。极少数肿瘤标志物如PSA，PAP，甲状腺球蛋白具器官特异性，但不具肿瘤特异性。,通常不能进行确诊。 因为肿瘤标志物无足够的灵敏度，不能排除假阴性结果。 本周蛋白(多发性骨髓瘤）、AFP（肝癌）、-HCG（绒毛膜癌）和降钙素 （甲状腺C-细胞癌）等有助确诊。,临床常用肿瘤标志物的组合,临床常用肿瘤标志物的组合,人附睾上皮分泌蛋白4（HE4）,甲胎蛋白是在胎儿血清中发现的一种转移性的甲种球蛋白。AFP主要由胚胎卵黄囊、胚胎肝细胞及其他内胚层分化的胃肠组织合成。 卵巢癌等患者AFP水平升高，68%-92%卵黄囊肿瘤患者也可见血清AFP上升。此外，胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌等均可发现AFP水平升高，但是升高水平均不及原发性肝癌患者。,人附睾上皮分泌蛋白4（HE4）,癌胚抗原属于非器官特异性肿瘤相关抗原，首先从胎儿及结肠癌组织中发现。分泌CEA的肿瘤大多位于空腔脏器，如胃肠道、呼吸道、泌尿道等。正常情况下，CEA经胃肠道代谢，而肿瘤状态时的CEA则进入血清和淋巴循环，引起血清CEA异常增高。,人附睾上皮分泌蛋白4（HE4）,（2）乳腺癌、腺胰癌、胆管癌、胃癌、食道癌、肺癌和泌尿系肿瘤等，阳性率50%-70%。,（1）原发性结肠癌患者，CEA升高者占45%-90%。,（3）术后CEA持续阳性，说明手术切除不完全或癌肿发生转移，提示病人预后较差或有复发的可能。,人附睾上皮分泌蛋白4（HE4）,（5）由于吸烟会影响血清CEA值，应用CEA作为辅助临床诊断时，需根据病人的症状、体征、其他检验结果，做出正确的诊断。,（4）良性肿瘤、炎症和退行性疾病，如结肠息肉、溃疡性结肠炎、胰腺炎和酒精性肝硬化病人CEA也有部分升高，但远远低于恶性肿瘤，一般小于20g/L。,人附睾上皮分泌蛋白4（HE4）,CA15-3是一种多形态上皮糖蛋白，为乳腺癌患者术后复发的最佳指标。妊娠三个月的孕妇可见中等程度升高。CA15-3存在于多种腺癌内，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌及卵巢癌等。,人附睾上皮分泌蛋白4（HE4）,癌抗原CA125属于一种与上皮性卵巢癌相关的高分子糖蛋白，表达于胚胎体腔上皮组织，存在于上皮性卵巢癌组织和病人的血清中。CA125主要用于辅助诊断恶性浆液性卵巢癌，上皮性卵巢癌，同时也是卵巢癌术后、化疗后疗效观察的指标。应持续动态的观察。,人附睾上皮分泌蛋白4（HE4）,人附睾上皮分泌蛋白4（HE4）,（2）健康人群中的鳞状细胞恶性肿瘤的早期筛查。,（1）子宫颈癌、肺癌、食道癌、头颈部肿瘤和外阴部肿瘤的诊断、手术或放化疗前后的疗效观察及复发预测。,人附睾上皮分泌蛋白4（HE4）,CYFRA21-1是由抗细胞角蛋白19片断的单克隆抗体BM9-21及Ks19-1所证实的抗原，是检测非小细胞肺癌的首选肿瘤标志物。此外，CYFRA21-1的浓度升高也可见于乳腺癌、食管癌和头颈癌等。,前列腺特异性抗原（PSA）,PSA是前列腺的特异性标记物 属于器官特异性抗原，不具备肿瘤特异性PSA属于酶类肿瘤标记物，具有糜蛋白酶 样和胰蛋白酶的活性PSA在正常男性含量小于4g/L,游离PSA在正常男性含量小于1g/L前列腺癌、前列腺增生、前列腺炎和前列腺损伤都会导致血清PSA升高血清 PSA在男性其他正常组织中和患其他癌肿时血清PSA都不会升高。,肿瘤标记物的临床意义,一般人群筛选 有限 在有症状的人群中作辅助诊断 可以 肿瘤分期 有限 预测预后 可以 监测治疗效果 可以 追踪疾病的复发 可以,（二）性激素相关指标,激素分类,蛋白激素 促性腺激素释放激素(GnRH) 促黄体激素 (LH) 促卵泡激素 (FSH) 人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 抑制素 (Inhibin) 泌乳素 (Prolactin),类固醇激素 雌性激素 雌酮 (E1) 雌二醇 (E2) 雌三醇 (E3) 孕酮 雄性激素 睾酮 双氢睾酮 (DHT) 雄烯二酮 雄酮 脱氢表雄酮 (DHEA) 硫酸脱氢表雄酮 (DHEA-S),生殖内分泌激素的检测,内分泌失调疾病的诊断和管理 儿童时期 青春期 成年期 绝经期和更年期 不育和辅助生殖 胎儿健康,性激素常用检测菜单,妊娠相关激素 人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 内分泌状况评估性激素六项 促黄体激素 (LH) 促卵泡激素 (FSH) 泌乳素 (Prolactin) 孕酮 睾酮 雌二醇 (E2),唐氏三联筛查 甲胎蛋白（AFP） 人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 雌三醇 (E3)肾上腺皮质功能评估 硫酸脱氢表雄酮 (DHEA-S),（三）骨质疏松相关指标,73,骨质疏松症 定义,一种全身骨代谢障碍的疾病，其实质为 骨组织显薇结构受损 骨矿成分比例减少 骨质变薄，骨小梁数量减少 导致 骨脆性增加，骨折风险升高 临床表现 患者臀部、脊柱、腕部易骨折 与年龄相关，女性多发于男性,74,10 20 30 40 50 60 70 80 90,年龄,生长期,缓慢丢失,持续丢失,快速丢失,绝经期,骨丢失速率,骨密度,骨峰值,骨折阈值,骨质疏松症 发病率,75,Bone Marker 骨代谢标志物,76,骨形成标志物 N-MID Osteocalcin （N-端骨钙素） P1NP （总1型原胶原氨基端延长肽） 参与骨形成的标志物 25-(OH) Vitamin D3 （25-羟维生素D3） PTH （甲状旁腺素） 骨吸收标志物 -crosslaps (CTX) -胶原降解产物 与骨质疏松相关的标志物 激素,主要骨标志物介绍,77,N-MID Osteocalcin （OC） N-端骨钙素,生物学特性: 骨合成过程中由成骨细胞产生 Vit K依赖性，49个氨基酸组成，分子量约为5.8 KD 骨基质中最重要的特异性非胶原钙结合蛋白,78,临床意义:反映成骨细胞功能的特异标志物 血清（血浆）含量异常，多见于 骨质疏松 原发/继发性甲状旁腺功能亢进 Pagets病 IOF（国际骨质疏松基金会）导则推荐使用的骨形成标志物 骨钙素 tP1NP或碱性磷酸酶,N-MID Osteocalcin （OC） N-端骨钙素,79,Vitamin D 维生素,维生素D, 又名抗佝偻病维生素，钙化醇；人体维生素D, 主要来源于日照（7脱氢胆固醇） 少量来源于动物性食物（如大马哈鱼，青鱼等） 或通过药物来补充 维生素D缺乏的原因 外周循环的维生素D水平随着年龄而下降 日照减少，摄食减少 肾功能有问题 胃肠功能紊乱等,80,最终的活性产物1, 25 (OH)2 Vitamin D的生理作用： 促进小肠对钙、磷的吸收 促进细胞外钙离子，通过和PTH相互作用达到平衡状态 促进骨骼钙化 Vit D缺乏导致缺钙，临床表现为: 骨密度下降 高的骨转换 骨折风险增加 骨软化 骨骼，肌肉疼痛或/无力,25-(OH) Vitamin D3 25-羟维生素 D3,81,PTH 甲状旁腺素,生物学特性: 甲状旁腺主细胞分泌的84个氨基酸组成的多肽 分子量约为9.5 KD 分泌呈现日夜节律波动(6:00最高，16:00最低) 临床意义: 与降钙素、Vit D协同作用，调节钙、磷水平，升钙降磷 促进小肠粘膜上皮细胞对钙的吸收 促进骨盐沉积和骨的形成,82,激素 辅助风险评估,雌激素 提高成骨细胞的活性。 低水平： 10 pg/ml 骨质流失轻度增加, 5 pg/ml 流失严重 男性： 13 pg/ml 骨折风险亦增加 睾酮 男性性功能减退 (游离睾酮 9 pg/ml) 与轻度臀部骨折相关。 性激素结合球蛋白(SHBG) 血液中的运输性激素的蛋白质 高浓度的SHBG 可降低游离激素的生物活性 增加男性和绝经后女性的骨折风险 SHBG与BMD呈负相关。,（四）感染相关指标,TORCH,目前科室主要检测仪器,DiaSorin Liaison 全自动化学发光免疫分析仪,目前科室主要检测仪器,雅培 ARCHITECT I1000 免疫分析系统,目前科室主要检测仪器,罗氏 Cobas e411 全自动电化学发光分析仪,88,思考题：,1放射免疫分析的原理及必备条件？ 2肿瘤标志物的分类及其对肿瘤诊断的意义？ 3免疫标记技术的分类及其各自优势？ 4性激素的分类及其临床意义？,89,5.以放射免疫分析为例(放射性总计数T为1500)，分析红色曲线的原因，纵坐标表示？横坐标表示？其原因有哪些？,