单克隆抗体的应用前景PPT课件

单克隆抗体的应用前景及进展,1,动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。,概念？,特定抗原,一种B细胞,特异性抗体,刺激,产生,2,杂交瘤细胞,挑选出一个产生特异性抗体的细胞在体外持久培养进行克隆增殖，便可同时得到大量均一的单克隆抗体。但是抗体形成细胞在体外持久培养困难，如脾细胞体外培养一般一周内死亡。可是恶性肿瘤细胞的特点之一是在体外培养中可无限期地增殖。用淋巴细胞杂交瘤技术，使抗体形成细胞和骨髓瘤细胞杂交，得到的杂交瘤细胞。这种细胞保持了亲代细胞双方的特性，既具有肿瘤细胞在体外培养中可以无限期地增殖的特性，又具有抗体形成细胞的不断分泌特异性抗体的特性。,3,典型例子,4,优点,和常规抗血清相比,1.特异性强：单克隆抗体是针对抗原分子表面抗原决定簇的，有人陈为“单特异性”。它是研究生物大分子和细胞表面细微结构以及诊断治疗疾病的有力工具。2.可大量生产，容易标准化：一旦获得1株杂交瘤细胞株，就可以无限制地反复制备出相同特异性的单克隆抗体。由于来自同一株细胞，很容易标准化。3.用不纯的抗原，可以制备出纯的单克隆抗体。用这种抗体又可以提纯抗原。因为具有上述特点，单克隆抗体应用范围很广，几乎渗透到生物医学的每一个领域，在生物医学研究，临床医学，军事医学和工业生产上都有重要的实用意义。,5,单克隆抗体，简称单抗药物，有“生物导弹”之称，目前是生物制药产业中最大类别的产品，也是生物制药产业中增长最快的领域之一。全球领先的医药健康咨询服务公司IMSHealth数据显示，2009年全球15大畅销药品中，抗体药物占据了1/3。业内人士普遍认为，单克隆抗体药物是中国生物医药产业发展潜力最为巨大的新药方向。,前景：,6,7,应用前景,单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。例子：用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。,1 作为亲合层析的配体,8,2 作为生物治疗的导向武器 包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。例子：热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。常见抗肿瘤细胞毒剂：化疗药物、细 菌毒素、植物毒素或放射性同位素等。优点:这不仅提高了抗体的疗效，也 可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。瓶颈：应用于临床，目前还存在不少 技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问 题等。,9,抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。例1：注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。例2：对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。,3 作为免疫抑制剂,10,利用单克隆抗体的特性可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。例子：用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。 制作生物芯片（即蛋白质芯片）以及用于western杂交。,4 作为研究工作中的探针,11,抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原抗体复合物型治疗性疫苗。,5 增强抗原的免疫原性,注：抗原的免疫原性，首先决定于其自身的化学特性，但同一种抗原，对不同种动物或同种动物不同个体间其免疫原性强弱，可表现很大差异，因此一种抗原的免疫原性是由其化学性质和宿主因素决定的。,12,单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：,6 作为医学检验试剂,(1)诊断各类病原体 这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势,13,用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。 随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。,(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测,14,用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。,(3)检测淋巴细胞表面标志,15,应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-910-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。,(4)机体微量成分的测定,16,单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗属于鼠源性，鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（Human anti-mouse antibody,HAMA）反应，大大限制了其临床应用价值。而且，鼠源性抗体在人体内半衰期缩短，生物活性降低。因此，人们一直致力于人源性抗体的研究。,瓶颈,17,以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的DNA，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原的子文库。以该技术制备的抗体片段(Fab)是人源抗体，具有建库简单、抗体表达稳定等特点。迄今已有多种抗体产生。可以预见，该技术具有良好的发展和应用前景。,解决方案：,（1）如用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交；,（2）用EB病毒转化人的B淋巴细胞；,（3）用基因工程法制备嵌合抗体等。,困难,（4）最新方法：噬菌体技术和转基因鼠技术,18,人源化治疗性单克隆抗体的研究进展,构建的基本思路,鼠抗体人源化就是通过基因改造，使其和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导HAMA（人抗鼠抗体）反应。对鼠源抗体 进行人源化改造时要遵守两个原则，首先要保持抗体的亲和力和特异性，其次要降低或消除抗体的免疫原性。,19,单克隆抗体的发展史,第一代：鼠源性单抗,药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克隆抗体药物中使用。,第二代：人鼠嵌合性单抗,进行人源化改造，使其人源化程度达到70%左右。,第三代：CDR移植抗体和SDR移植抗体,人源化程度达到95%左右，大大降低了毒副作用。,第四代：全人源化单抗,2002年，的世界首个药物阿达木单抗上市。人源化及全人源单克隆抗体由于副作用小，在体内停留时间长，更有利于治疗。,20,人源化程度,21,1.嵌合抗体（Chimeric antibody),用人源基因代替鼠源单抗的恒定区，即该单抗由鼠的可变区和人的恒定区组成的嵌合抗体。,由于嵌合抗体可变区（V）约占整个抗体的30%，鼠源性抗体V区中的框架区（FR)仍残留一定的免疫原性，可诱导HAMA反应。,灵长目源抗体也是一类嵌合抗体，通过免疫短尾猿猴产生。由于其抗体的可变区与人可变区无差异，不至于发生抗体反应。,缺点,解决方案,22,2.CDR移植抗体（CDR grafted antibody),真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区（CDR）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可达到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。,不足,有时异基因的CDR人源化抗体可能引起抗个体基因型反应。,改良方案,进行SDR移植改良,23,3.SDR移植抗体(SDR grafted antibody),在CDR移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结合密切相关的SDR等少数残基移植到人抗体相应位置上，进一步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源化的抗体潜在的免疫原性降至最低。,24,4.全人单克隆抗体（Fully humaneantibody),它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性。,4.1.抗体库筛选技术,4.1.1.噬菌体表面展示技术,25,用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样一来噬菌体DNA中有抗体基因的存在，同时在其表面又有抗体分子的表达，就可以方便地利用抗原-抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，则可获得可溶性的抗体片段。,基本原理和程序,26,4.1.2.核糖体展示技术,它将正确折叠的蛋白及其 mRNA同时结合在核糖体上， 形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体，使目的蛋白的基因型和表型联系起来，构成核糖体展示的蛋白文库， 然后用相应的抗原从翻译混合物中进行筛选， 以乙二胺四乙酸 （EDTA） 解离结合的核糖体复合物或以特异抗原洗脱整个复合物，并从中分离 mRNA。通过反转录聚合酶链反应（RT- PCR） 提供下一轮展示的模板， 所得 DNA进入下一轮富集，部分 DNA可通过克隆进行测序分析等。 利用此技术可以获得特异性的、高亲和力的抗体。,27,4.2.转基因小鼠,通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇的转基因小鼠。这种人抗体基因小鼠所携带的人DNA片段具有完善的功能，可以有效地进行同型转换和亲和力成熟。任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的人抗体。,案例：,日本麒麟公司用基因工程技术，使小鼠携带完整的人14号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因。,但迄今尚无该技术生产的制品问世。,28,4.3.微胞杂交干细胞技术,日本学者Ishida等首先提出,技术要点： 首先将抗G418的人成纤维细胞与小鼠的A9细胞融合，通过筛选，得到抗G418的小鼠A9细胞，再运用PCR或原位荧光杂交方法筛选，先筛选出的细胞用秋水仙素处理48h，然后用细胞松弛素B处理并高速离心，分离出含2号、14号、22号染色体的小鼠。,人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较低。,29,4.4.其他方法,XTL生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植的方法，用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该公司已用此法生产出一种全人单抗。,30,31,应用单克隆抗体后的患者症状改善率,32,总结,到目前为止，至少有35个完全人类的单抗已经进入临床的治疗实验阶段。这些单抗的靶抗原都是临床癌疾病自身免疫疾病或炎症疾病和传染病中的主要抗原。例如EGFR/CTLA-4和CD4等。在治疗一些一种移植、骨质疏松症等疾病已有显著的效果。但是，免疫原性仍是存在的问题，因此，利用转基因鼠技术得到的单抗仍是未来药物的主流。抗体人源化以及完全人源化抗体的制备已经成为当今治疗性抗体的发展趋势，同时，各种抗体衍生物免疫原性低、更易通过血管壁到达病源，通过PEG化等方法可以延长其半衰期；人抗体是否可以解决鼠抗体运用中出现的所有问题，还有待大量临床试验的检验。所以可行的方法就是在完善人抗体技术的同时，推进治疗性小分子衍生物的研究，根据临床的实际设计灵活有效的治疗方案，使人源化抗体和小分子抗体互为补充。,33,Thanks!,34,