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病原体分子诊断技术进展,1,分子诊断概念和特点,概念：利用标本中的核酸作为检测对象，对感染性疾病、肿瘤、遗传性疾病等进行诊断和预后判断的方法。 特点 特异性高、灵敏度高稳定性高诊断范围广、适应性强临床应用前景好,2,什么是核酸？,链状分子 DNA (脱氧核糖核酸)贮存遗传信息 RNA (核糖核酸)传递遗传信息,3,DNA 和 RNA 的区别,糖基 + Base,Nucleoside,+ Phosphate,P,Nucleotide,A、DNA和RNA的主要区别就在骨架上的糖基。 B、DNA很稳定，RNA不稳定。,4,RNA 和 DNA 的结构,dsDNA,ssDNA,ssRNA,5,通常RNA在细胞中拷贝数远高于DNA的拷贝数,6,如使用rRNA为靶标，将极大地提高了 取样效率和扩增检测灵敏度,A、如果2ml样本含有1个细菌取0.2ml样本，最终得到细菌的几率是1/10。,B、如果2ml样本含有1个细菌先裂解，后取样， 2ml样本含有10000个rRNA。取0.2ML样本，可得到 1000个分子,7,主要的核酸扩增技术,DNA扩增技术A、PCR：使用Taq酶进行扩增，温度循环；RT-PCR将RNA变成DNA，再进行DNA扩增B、实时荧光PCR：扩增与PCR相同，采用实时闭管荧光检测（分子信标，Taqman探针等） RNA扩增技术A、TMA：恒温扩增，使用RT酶和T7酶；终点杂交保护检测B、 SAT：扩增与TMA相同，采用实时闭管荧光检测（分子信标）,8,实时闭管荧光检测常见技术,9,PCR原理,10,Real-Time PCR,11,TMA原理,12,SAT 原理（实时荧光TMA）,13,SAT与PCR技术原理比较,14,DNA扩增技术（PCR）用于病原体 检验的不足,不能区分“活菌”“死菌” 与临床相关性差不能区分“潜伏感染”“活动性感染” 临床意义小，如CMV交叉污染变温检测，对仪器要求高 反应易受抑制,15,RNA扩增技术用于病原体 检验的优势,可以区分“死菌”“活菌”：病原体死亡，RNA很快降解与临床相关性好（培养），减少无效治疗，比如抗生素滥用 可以诊断“活动性感染”活动性感染：指示RNA转录活跃潜伏感染：指示RNA不转录 不易污染：靶标和扩增产物都是RNA 灵敏度高：RNA 拷贝数 DNA拷贝数,16,RNA诊断产品的商品化程度及应用,FDA或CE 认证产品 （TMA）,SFDA 认证 产品 （SAT） 沙眼衣原体（CT）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增） 淋病奈瑟菌（NG）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增） 解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增） 结核分子杆菌（TB）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增）,为什么我们必须熟悉和了解RNA扩增技术？（一）,17,为什么我们必须熟悉和了解RNA扩增技术？（二）,18,RNA 用于TB的检测（TMA）进入多国诊疗指南,1996：美国CDC首个NAAT技术在TB实验室诊断的应用的指南 TMA通过FDA认证，配合培养法对涂阳患者进行诊断 2000：美国CDC更新NAAT法在TB实验室诊断中应用的指南 TMA用于TB疑似患者(涂阳、涂阴)痰液检测、PCR用于TB涂阳患者的痰液检测 2007：加拿大卫生部TB诊断标准,为什么我们必须熟悉和了解RNA扩增技术？（三）,19,什么样的病原体需要分子诊断？,传统方法不能及时检测或鉴定的病原体。,20,与PCR、TMA等相比，SAT改进了捕获方法（一）,优点： 几乎去除了所有抑制剂 允许使用大体积样本 可同时处理多种样本,21,与PCR、TMA等相比，SAT开发了全自动样本处理方法（二）,全自动样本处理工作站,特点 不需要任何样本前处理 国内唯一全自动尿样（血样等）处理系统 1.5小时，96个样本,（RD Mag -96）,22,SAT应用例一（CT/NG尿液检测，国内唯一）,CT/NG 尿液检测,CT的反复感染不仅导致不育，而且增加感染淋球菌、HIV、HBV等风险（68倍）【1】,【1】李跃进,谭湘芳.荧光定量PCR检测性病的结果分析J.实用医技杂志,2007,14(16):2151.,23,RNA（TMA）检测尿液中的CT（美国）,尿液样本的灵敏度、特异性与拭子相当,Systematic Review: Noninvasive Testing for Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Ann Intern Med.2005;142:914-925.,24,SAT国内数据,检测样本量：1050例,25,SAT应用例二（结核分枝杆菌检测）,操作流程,26,1、以临床诊断的结果为金标准，对253例结核患者痰标本；134例其他呼吸道感染患者标本同时进行涂片、TB-SAT、 Bactec MGIT 960检测。,SAT检测痰液标本中的结核杆菌,27,28,SAT其它产品,29,小结,RNA诊断技术，包括SAT，应用于传染病诊断具有明显的优势。 我们预期，在接下来的十年里，RNA诊断技术将对传染病的诊断带来革命性的变化。,30,
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