粮油检验 粮食中黄曲霉毒素的测定 免疫磁珠净化超高效液相色谱法-征求意见稿

ICS   点击此处添加中国标准文献分类号LS中 华 人 民 共 和 国 粮 食 行 业 标 准LS/T XXXXXXXXX粮油检验 粮食中黄曲霉毒素的测定 免疫磁珠净化超高效液相色谱法Inspection of grain and oils Determination of aflatoxins in grains and oilsultra high liquid chromatography with immunomagnetic bead cleanup点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施国 家 粮 食 和 物 资 储 备 局    发 布XX/T XXXXXXXXX1前    言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由国家粮食和物资储备局提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAT/TC 270）归口。XX/T XXXXXXXXX2粮油检验 粮食中黄曲霉毒素的测定 免疫磁珠净化超高效液相色谱法1. 范围本标准规定了采用免疫磁珠净化超高效液相色谱测定粮食中黄曲霉毒素B1、B 2、G 1、G 2（AFB 1、AFB 2、AFG 1、AFG 2）的原理、试剂和材料、仪器和设备、分析步骤、测定、结果计算和精密度等内容。本标准适用于小麦、玉米、稻谷和植物油等粮油样品中 AFB1、AFB 2、AFG 1或 AFG2的测定。本标准 AFB1的检出限为 0.1g/kg，AFB 2的检出限为 0.03g/kg，AFG 1的检出限为0.1g/kg，AFG2 的检出限为 0.03g/kg，AFB 1的定量限为 0.3g/kg，AFB 2的定量限为0.1g/kg，AFG 1的定量限为 0.3g/kg，AFG2 的定量限为 0.1g/kg。2. 规范性引用文件下列标准对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用标准，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用标准，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T 5491 粮食、油料检验 扦样、分样法GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3. 原理样品采用乙腈-水溶液提取，提取液经稀释、离心后，经黄曲霉毒素免疫磁珠净化、过膜后，超高效液相色谱分离，荧光检测器检测，外标法定量。4. 试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中一级用水要求。4.1. 乙腈：色谱纯。4.2. 甲醇：色谱纯。4.3. 氯化钠：分析纯。4.4. 磷酸氢二钠：分析纯。4.5. 磷酸二氢钾：分析纯。XX/T XXXXXXXXX34.6. 氯化钾：分析纯。4.7. 盐酸：分析纯。4.8. TritonX-100C14H22O(C2H4O)n(或吐温-20,C 58H114O26)：分析纯。4.9. 提取液：乙腈-水混合液（70:30，体积比）。4.10.磷酸盐缓冲溶液(以下简称 PBS):称取 8.00 g 氯化钠、1.20 g 磷酸氢二钠(或 2.92 g 十二水磷二钠)、0.20 g 磷酸二氢钾、0.20 g 氯化钾,用 900 mL 水溶解,用盐酸调节 pH 至 7.4,用水定容至 1000 mL。4.11.1%TritonX-100(或吐温-20)的 PBS 溶液(以下简称 PBST):取 10mLTritonX-100,用 PBS 定容至1000 mL。4.12.标准品黄曲霉毒素 B1、B 2、G 1、G 2的固体粉末 (纯度99%)或有证标准溶液，4 种真菌毒素的信息参见附表 A。4.13.标准溶液配制4.13.1. 混合标准溶液准确移取一定体积或质量的 4 种真菌毒素标准品（4.12）于 10 mL 容量瓶中，配制黄曲霉毒素B1、B 2、G 1、G 2浓度分别为 0.1、0.03、0.1、0.03 g/mL，用甲醇定容至刻度，此溶液-20 C 密封避光保存，有效期 6 个月。4.13.2. 标准系列工作溶液准确移取 4 种真菌毒素混合标准溶液（4.13.1）25 L、50 L、100 L、250 L、500 L、1000 L分别于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制标准曲线溶液浓度见表 1，此溶液 4避光密封保存，有效期一周。表 1 标准曲线溶液浓度梯度浓度g/L 名称标曲点 1 标曲点 2 标曲点 3 标曲点 4 标曲点 5 标曲点 6AFG2 3 1.5 0.75 0.3 0.15 0.075AFG1 10 5 2.5 1 0.5 0.25AFB2 3 1.5 0.75 0.3 0.15 0.075AFB1 10 5 2.5 1 0.5 0.25XX/T XXXXXXXXX44.14.塑料离心管（1.5 mL、10 mL、50 mL）。4.15.聚四氟乙烯针头过滤器（13mm 孔径 0.2m）。4.16.玻璃内插管（400L）。4.17.色谱进样瓶（2mL）。4.18.塑料无菌注射器（2mL）。4.19.容量瓶（10mL）。4.20.黄曲霉毒素免疫磁珠：10 mg/mL。注：为便于操作，可采用满足要求的商品化免疫磁珠试剂盒。5. 仪器和设备 5.1. 超高效液相色谱-荧光检测器。5.2. 冷冻离心机：转速12000 r/min，可设 4。5.3. 天平：感量 0.1 mg 和 0.01 g。5.4. 涡旋混合器。5.5. 振荡器（振荡频率50 次）。5.6. 单通道移液枪一套（最大量程分别为 20 L、100 L、200 L、1000 L）。5.7. 超声仪。5.8. 分液器（量程 10-100 mL）。5.9. 高速粉碎机。5.10.筛网：1mm 试验筛孔径。6. 分析步骤6.1. 扦样与分样按 GB/T 5491 执行，在采样过程中，注意防止样品污染。6.2. 样品粉碎对于固体样品经粉碎机粉碎，过1mm孔径试验筛，混匀，待测。6.3. 提取及净化准确称取 5 g（精确到 0.01g）样品于 50 mL 离心管中，加入 20 mL 提取液（4.9） ，涡旋提取 20 min，然后以 6000 r/min 离心 5 min，吸取 0.5 mL 上清液于 10 mL 离心管中，加入 4.5 mL XX/T XXXXXXXXX5PBST（4.11）并涡旋混匀，取全部混合液于 10 mL 深孔板中，加入 100 L 黄曲霉毒素免疫磁珠振荡反应 5 min，磁吸分离 30s 后将磁珠转移至 1 mL PBS（4.10）振荡 1min，磁吸分离 30s 后将磁珠转移至 1 mL 水振荡 1min 后，磁吸分离 30s 后将磁珠转移至 0.5 mL 甲醇（4.2）振荡 1 min，磁吸分离30s，收集上清液于进样瓶中以备进样。注 1:采用商品化免疫磁珠试剂盒时，按照其使用说明进行。注 2:全自动(在线) 或半自动 (离线)的免疫磁珠净化仪器可优化操作参数后使用。7. 测定7.1. 液相色谱参考条件超高效液相色谱仪:包括超高效液相色谱仪、超高压液相色谱仪和超高速液相色谱仪，配备荧光检测器和数据处理系统。色谱参考条件：色谱柱：C18 柱。荧光检测波长：激发波长 360 nm；发射波长 440 nm。流动相：A：甲醇，B：水。等度洗脱，A：B=40:60。流速：0.2 mL/min。柱温：30。进样量：2 L。7.2. 标准曲线的制作黄曲霉毒素标准工作溶液(4.13.2)由低到高注入液相色谱检测分析。以黄曲霉类毒素标准工作液浓度为横坐标，相对应色谱峰峰面积为纵坐标，得到标准线性回归方程。7.3. 试样溶液的测定待测样液（7.2）中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，浓度超过线性范围的样品则应稀释后重新进样分析。8. 结果计算样品中黄曲霉毒素的含量按式(1)计算：(1)1234()cVXm式中：X 样品中 AFB1、AFB 2、AFG 1或 AFG2的含量，单位为微克每千克（g/kg ） ；c 按上机溶液中 AFB1、AFB 2、AFG 1或 AFG2的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL） ；V1 提取液的体积，单位为毫升(mL)；V2 用于稀释的提取液体积，单位为毫升(mL)；XX/T XXXXXXXXX6V3 用于稀释的稀释液体积，单位为毫升(mL)；V4 用于免疫磁珠的洗脱液体积，单位为毫升(mL)；m  样品的称样量，单位为克（ g） 。计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算数平均值表示，保留至小数点后两位。测定结果不符合重复性要求时，应按 GB/T 5490 的规定重新测定，计算结果。9. 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15%。