编制说明-粮油检验 粮食及其制品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测-征求意见稿

- 1 -粮油检验 粮食及其制品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留的快速检验标准编制说明有机磷类和氨基甲酸酯类农药是目前最常用的农药之一，广泛用于粮食作物的生产和储藏。过量残留在粮食作物上的农药可经消化道、呼吸道及完整的皮肤和粘膜进入人体，对人体造成不同程度的损害，影响人们的健康。近年来，粮食作物中因为农药残留超标的报道时有发生。究其原因主要在于：一是不按规定的用药量、次数、方法或安全间隔期施药，或施用禁用的剧毒、高毒农药；二是我国现有粮食农药残留检测标准方法需要使用大型分析仪器，缺乏现场、快速的标准检测方法使得基层的粮食农药残留检测能力不足导致的监管真空。因此，建立适合于我国国情的粮食中农药残留快速检测标准方法，对于指导、规范农户合理施药，提升基层监管部门的农药残留监测能力，加强粮食质量安全水平，有着重要的现实意义。 农药残留量检测是微量或痕量分析,必须采用高灵敏度的检测技术才能实现。自 20 世纪 50 年代，各国科学家就开始研究农药残留的检测方法，常用的农残检测方法包括色谱法和快速检测方法。色谱法包括气相色谱、气相色谱-质谱联用、高效液相色谱、液相色谱-质谱联用等，其中气相色谱技术的引进极大地推动了农药残留分析的发展，有效的提高了农药残留分析检测的水平；高效液相色谱法作为目前发展最快、应用最广泛的分析技术，对于气相色谱法不能分析的高沸点、热稳定性差和极性农药及其代谢物，可以进行有效的分离检测；质谱以及色谱-质谱联用技术的应用，使农药残留分析从一种或几种农药发展到可同时测定几十种上百种不同种类的农药，实现了对农药的高通量，高灵敏度的定性、定量检测。虽然色谱类方法结果准确可靠、灵敏度高，但由于需要大型的色谱、质谱设备，检测成本高，同时对操作人员水平要求高，限制了其在基层实验室的应用。快速检测方法由于具有操作简便，检测时间短，成本低，无需大型仪器等优势，适合于基础现场的快速筛查。目前的快速检测方法主要包括化学速测法、免疫分析法、酶抑制法和生物荧光法等。化学速测法主要根据氧化还原反应，水解产物与检测液作用变色，常用于有机磷农药的快速检测，但是化学速测法灵敏度低，使用有局限性，且易受还原性物质干扰，因此应用较少；免疫分析法最常用的是酶联免疫分析法（ELISA），以抗原与抗体的特异性、结合反- 2 -应的可逆性为基础的检测技术，灵敏度高、选择性好，但通常只能检测一种农药，无法进行多残留检测；而酶抑制法是在昆虫毒理学基础上发展起来的，基于农药能抑制动植物体内某些特定的生物酶(如乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、植物水解酶等) 活性，通过肉眼或仪器观察显色反应，从而对样品中的农残进行定性检测，酶抑制法可同时检测有机磷和氨基甲酸酯两大类农药残留，因具有快速、操作简便、成本低廉等特点而被广泛应用，但是这种方法灵敏度较低，许多目标物的灵敏度无法满足国家限量要求；生物荧光法在酶抑制法的基础上进行改进，通过使用荧光检测代替传统的分光光度法，有着更高的灵敏度，适用范围更广。鉴于国内外对食品安全的日益重视，有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留对人体健康的危害，我国先后制定出台了一系列的有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留标准方法，其中标准方法蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测（GB/T 5009.199-2003），可用于蔬菜现场基层快速检测，但是由于粮食基质和蔬菜基质相差较大，无法用于粮食样品的快速检测。同时由于标准的判定方法过于粗犷，假阳性和假阴性较高，此外方法的灵敏度较低，无法满足多数限量浓度农药的检测，因此建立适用于粮食及其制品的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的高灵敏度检测方法标准，满足限量检测筛查的需求，提升我国粮食农残基层现场的检测能力势在必行。1 工作简况1.1 任务来源及起草单位根据国家粮食局办公室关于下达 2017 年第三批粮油行业标准制修订计划的通知（国粮办发【2017】297 号）的要求，由国家粮食局科学研究院负责粮油检验 粮食及其制品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留的快速检验起草工作。起草单位成立标准起草组进行本标准制定的各项工作。1.2 标准研制主要工作过程- 3 -（1）根据该标准的特点，2017 年 11 月-2017 年 12 月，查询了国内外资料，对相关检测机构、粮库、粮食加工企业进行了调研，并召开了第一次讨论会，确定了标准制订方案和工作计划。（2）2018 年 1 月-2018 年 4 月，在国家粮食局科学研究院实验室进行标准的研制工作，主要包括方法的建立，方法灵敏度测试，重现性和再现性的验证等。（3）2018 年 5 月，编写了粮油检验 粮食及其制品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留的快速检验标准草案，并召开了第二次讨论会，并组织了实验室间方法验证。（4）2018 年 6 月-2018 年 7 月，验证结果处理统计并形成标准编制说明。 （5）2018 年 7 月，标准草案的意见征询。2 标准的编制原则和标准的主要内容2.1 标准编制原则本标准是根据 GB/T1.1-2009标准化工作导则第 1 部分：标准的结构与编写规则、GB/T20001.4-2009标准编写规则第 4 部分：化学分析方法的规定进行编制的。2.2 确定标准主要内容2.2.1 标准的适用范围本标准规定了粮食及其制品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测的原理、试剂及材料、仪器及设备、样品制备、样品测定、结果表述等。本标准适用于粮食及其制品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测。2.2.2 标准研制的总体思路酶抑制法是目前最为广泛的农残快检方法，但是由于目前常规的酶抑制法采用的是乙酰胆碱酯酶和显色反应，灵敏度较低，能够满足限量筛查要求的农药种类较少（4-6 种），无法满足现有的大量农残的筛查需求。本标准采用了昆虫酯酶，是一种新型高活性改进酶。该酶其与农药残留的结合能力高于传统的乙酰胆碱酯酶，且底物经过修饰，增加了酶与底物的特异性结合能力。同时本方法采用了高灵敏的荧光底物代替传统的显色底物，进一步- 4 -提高了方法的灵敏度。因此，本方法的检测灵敏度高，可以基本满足食品中农药残留最大限量（GB 2763-2016）规定的有机磷类和氨基甲酸酯类农药限量浓度检测的要求。2.2.2.1 方法的优化本标准采用的结果以样品中的农药残留对酶的抑制的程度（酶抑制率）表示，酶抑制率按式（1）计算：（1）010()/yI式中：酶抑制率（% ）y空白试验响应值0I待测样品响应值1其中 GB/T 5009.199-2003 的判定根据抑制率是否大于 50%来判断，当抑制率大于 50%时，结果为阳性，小于 50%时，结果为阴性。但是由于有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留种类多，浓度相差大，不同基质间限量可能不同，这些因素都会导致农药的阳性抑制率不在 50%， 因此，按照 GB/T 5009.199-2003 中单一的使用抑制率 50%作为结果的判定标准，必然导致方法筛查的准确性差，表 1 为部分常见农残的限量浓度时的抑制率情况，可以看出，多数农药限量浓度的抑制率不在 50%左右，直接采用 50%抑制率进行判定，容易产生较高的假阳性率和假阴性率，导致筛查的结果不准确。表 1 部分常见农残的限量浓度时的抑制率限量浓度的抑制率/% 糙米 玉米 小麦敌敌畏 60.67 50.58 36.95 对硫磷 49.18 41.05 43.96 甲萘威 65.08 - -克百威 48.41 - 38.64 辛硫磷 40.62 42.97 43.25 本标准基于方法实用性的考虑，提出以 GB 2763-2016 限量浓度的抑制率进行判定的模式。通过比较样品和目标农药残留限量浓度的抑制率进行判定结果，当样品的抑制率高于- 5 -判定抑制率，表示样品中可能有高剂量有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留存在，该样品判定为疑似阳性样品，对疑似阳性样品，需用参考方法进一步复检，确定具体农药的种类和含量。当样品的抑制率低于判定抑制率，表示样品中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留较低，该样品判定为阴性样品。同时报告时应标明对何种目标农药残留呈疑似阳性或阴性。由于 GB/T 5009.199-2003 的判定为单一的评价方式（根据抑制率为 50%判断），对于限量抑制率不在 50%附近的农药而言，其准确性较差，如甲萘威（限量抑制率为 65.08%），辛硫磷（限量抑制率为 40.62%）的正确率只有 63%和 33%。新标准方法中利用限量抑制率判定，可以准确得到各个农药的限量抑制率，利用其真实的限量抑制率而不是通用的抑制率 50%进行判定，使得单个农药的判定假阳性率，假阴性率都有显著的降低，正确率从原来的 33%78%提升至 74%94%，显著提高了方法的准确性。由于粮食及其制品中有机磷类和氨基甲酸酯农药种类高达 150 种，大量潜在目标物，必然导致筛查结果的不准确，因此为了提高方法筛查的准确性，标准中明确了利用现有已知条件，尽量减少目标物范围，提高判定结果。根据样品基质种类，可以有效排除一大批该基质种类无限量要求的农药，根据样品的来源及产地农残监测情况和施药指南情况，可以进一步降低目标农药种类，缩小到尽量少的范围内，确定可能的目标农药种类，提高方法的准确性。2.2.2.3 方法的验证（1）检出限本方法的检出限如下表所示，可以看出，本方法的检出限可以满足粮食中有机磷和氨基甲酸酯限量检测的要求。表 2、农残限量及本方法检出限汇总英文名称 中文名称MRL*（ppb）农药检测限（ppb）代谢产物检测限（ppb）英文名称 中文名称 MRL（ppb）农药检测限（ppb ）代谢产物检测限（ppb）Phoxim 辛硫磷 50 0.5  Malaoxon 马拉氧磷  0.7 Azinphosmethyll谷硫磷      0.3 Malathion 马拉硫磷8000（麦类/旱粮类/稻谷）/100（大米）2Carbopheno 三硫磷  2 0.3 Methidathion 杀扑磷 50  0.6- 6 -thionCarbophenoxon杀螨硫磷  0.3  Methyl paraoxon 甲基对氧磷  0.1 Chlorfenvinphos毒虫畏  0.5  Methyl parathion 甲基对硫磷200（稻谷）/20（麦类/旱粮 /杂粮）0.1Chlorpyriphos毒死蜱 500 50 0.3 Mevinphos 速灭磷  0.1 Coumaphos 蝇毒磷  50 0.1 Monocrotophos 久效磷 20 50 Crotoxyphos巴毒磷  0.25  Naled 二溴磷  0.2 Crufomate 育畜磷  4  Paraoxon 对氧磷  0.2 Diazinon 二嗪磷 20 2.5  Parathion 对硫磷100（麦类/旱粮类）20 0.1Dichlorvos (DDVP)敌敌畏 100 0.25  Phorate 甲拌磷50（稻谷/糙米/玉米/杂粮类）/20（麦类/小麦/旱粮类（玉米除外）0.6Dimethoate 乐果 50  12.5 Phorateoxon 氧甲拌磷  0.6 Disulfoton 乙拌磷   3.5 Phosalone 伏杀硫磷  60 0.1EPN 苯硫磷   0.1 Phosphamidon 磷胺  20 Ethion 乙硫磷  2.5 0.6 Phosmet 亚胺硫磷 50（玉米）  0.5Ethoprop 灭线磷20（稻谷）/50（麦类/旱粮/杂粮）5  Primiphosmethyl 甲基嘧啶磷  50 0.15Fenamiphos 苯线磷 20 7  Profenofos 丙溴磷  0.5 Fensulfothion丰索林  75 0.2 Tetrachlorvinphos 杀虫畏  0.3 Fenitrooxon 杀螟氧磷  0.1  Triazophos 三唑磷50（麦类/旱粮类/稻谷）0.1Fenitrothion 杀螟硫磷5000（麦类/旱粮类）/1000（大米）/100（稻谷）20 0.1 Trichlorfon 敌百虫  1 Fonofos 地虫硫磷 50 75 0.1 Aldicarb 涕灭威  12 Leptophos 溴苯磷   0.2 Carbaryl 甲萘威 1000（大米） 0.2 - 7 -Leptophosoxon溴苯氧磷  0.2  Carbofuran 克百威100（糙米）/50（麦类/旱粮 /杂粮）5 Oxamyl 杀线威  12  Isoprocarb 异丙威 200（大米） 2.5 Propoxur 残杀威  11  Methiocarb 甲硫威 50（小麦） 0.3 *MRL 来自GB 2763-2016 食品中农药残留最大限量（2）方法准确性利用本系统检测 10 个不同农残种类和含量的样品并与仪器检测结果比较，结果如表 3所示，其正确率为 80%。表 3 仪器方法一致性比较样品编号 LC/MS 检测结果（ ppb） 农残快检系统 结果 一致性分析敌敌畏（限量为 200） 克百威（限量为 100）  1 104.3 102.5 阳性 正确2 52.6 50.7 阳性 假阳性3 96.2 107 阳性 正确4 48.7 50.6 阳性 假阳性5 27.2 24.6 阴性 正确6 未检出 未检出 阴性 正确8 213 未检出 阳性 正确9 未检出 105.1 阳性 正确10 未检出 未检出 阴性 正确（3）实验室间联合验证本方法目前已经在湖北省粮油食品质量监督检测中心，河南省粮油饲料产品质量监督检验中心，安徽省粮油产品质量监督检测站等 12 家实验室验证。验证样品包括空白玉米样品，空白小麦样品，空白稻谷样品，加标浓度水平为 0.5 倍限量浓度，限量浓度，2 倍限量浓度三个水平。对 12 个实验室返回的 3087 个检测结果根据国标 GB/T6379.2-2004，采用柯克伦检验和格拉布斯检验剔除离群值。2 倍限量浓度加标水平无假阴性发生，限量浓度加标水平的假阴性率5%， 0.5 倍限量浓度加标水平的假阳性性率30% ，说明本方法在各实验室的准确性良好。重复性相对标准偏差 RSDr 10% 的占 76.2%，RSDr 15% 的占 95.2% ，说明本方法在各实验室的重复性良好。再现性 RSDR 15% 的占 66.7 % ; RSDR 20% 的占 76.1% ，说明本方法实验室间再现性良好。- 8 -3 采用国际标准和国外先进标准的情况，以及与国际、国外同类标准水平的对比，或者与测试的国外样品、样机的有关数据对比情况无4 与有关的现行法律、法规和强制性国家标准、行业标准的关系本标准颁布实施后，针对粮食中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测，符合现行的法律法规和强制性（国家、行业、地方）标准要求。5 重大分歧意见的处理经过和依据无。6 按照标准化法的有关规定，提出强制性标准或推荐性标准的建议建议将本标准列为推荐性行业标准。 7 废止现行有关标准的建议无8 其他应予说明的事项