粮油检验 粮食中霉菌计数 荧光检测法-征求意见稿

ICS 点击此处添加 ICS 号点击此处添加中国标准文献分类号LS中 华 人 民 共 和 国 粮 食 行 业 标 准LS/T XXXXXXXXX粮油检验 粮食中霉菌计数 荧光检测法Inspection of grainEnumeration of molds in grains by fluorescence点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施国 家 粮 食 和 物 资 储 备 局    发 布XX/T XXXXXXXXXI前  言本标准按照 GB/T1.12009 给出的规则起草。本标准由国家粮食和物资储备局提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAC/TC 270）归口。本标准附录A是规范性附录。XX/T XXXXXXXXX1粮油检验 粮食中霉菌计数 荧光检测法1 范围本标准规定了采用荧光检测法测定粮食及其制品中霉菌计数的术语和定义、原理、仪器和设备、培养基和试剂、操作步骤、计数和结果报告。本标准适用于谷物、豆类及其制品中霉菌计数的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求3 术语和定义3.1 霉菌计数 Enumeration of molds 样品经过处理，在一定条件下培养后，所得 1 g 检样中所含霉菌的数量。3.2 落形成单位 Colony-forming units, CFU菌一个霉菌在滤膜上生长形成可见荧光的菌落。4 原理待测样品稀释液经滤膜过滤后，霉菌被截留在滤膜上，经培养基扩增培养后再进行荧光标记，最终所有的霉菌菌落都会发出荧光。反应原理是荧光试剂中不发光的酶底物在霉菌体内参与新陈代谢时发生酶解反应，底物将独立的发光基团释放到霉菌的细胞质中，当发光基团在细胞内累积后，信号自然被放大，菌落在 490 nm 波长光线下被激发而显示荧光并被计数。5 仪器和设备5.1 电子天平：感量 0.1g。5.2 荧光检测器：波长为 490 nm，具有自动计数功能，可人工计数修正。5.3 拍击式均质器或振荡器。XX/T XXXXXXXXX25.4 涡旋混合器。5.5 抽滤器。5.6 真空泵。5.7 培养箱：281。5.8 灭菌锅。5.9 无菌均质袋或锥形瓶（容量 250 mL）。5.10 广口瓶：容量 500 mL。5.11 试管：18 mm 180 mm。5.12 无菌吸管：1 mL。 5.13 无菌微量移液器及枪头：1 mL。5.14 无菌培养皿：直径 90 mm。5.15 无菌疏水栅格滤膜：孔径 0.45 m，直径 47 mm。5.16 带垫片培养皿：直径 50 mm。6 培养基和试剂6.1 改良霉菌培养基：见附录 A。6.2 无菌生理盐水：称取 8.5 g 氯化钠溶于适量蒸馏水中，定容至 1000 mL 后分装到试管中，每管 9 mL，121 灭菌 15 min，备用。6.3 荧光显色液。7 操作步骤7.1 样品制备7.1.1 取样品 500 g 用谷物粉碎机磨细至粒径小于 1 mm（全部通过 1 mm 孔径的试验筛），充分混匀后准确称取 25 g 粉碎试样（精确到 0.1 g），加入含有 225 mL 无菌生理盐水的锥形瓶中，盖好瓶塞，放置到振荡器中震荡 30 min；或放入无菌均质袋中，加入 225 mL 无菌生理盐水，用拍击式均质器高速拍打 2 min，制成 1:10 样品稀释液。7.1.2 吸取 1 mL 1:10 样品稀释液注入含有 9 mL 无菌生理盐水的试管中，用涡旋振荡器混匀，即为1:100 稀释液。7.1.3 按 7.1.2 操作程序制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，更换一次无菌吸管或移液器枪头。7.2 样品过滤 XX/T XXXXXXXXX37.2.1 根据对样品污染状况的估计，选择 2-3 个适宜稀释度的样品稀释液进行过滤，每个稀释度分别吸取 1 mL 注入含有 9 mL 无菌生理盐水的试管中，用涡旋混合器混匀待滤，每个稀释度做 2 个重复。7.2.2 用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，将网格面向上贴放在过滤器的滤床上，按说明书要求固定好滤器，将试管中的待滤样品稀释液转移至滤器中，打开真空泵进行抽滤，抽滤完后再用 10 mL 左右无菌生理盐水冲洗试管后倒入滤器中，打开真空泵抽滤，待试液抽滤完后再抽气约 5 s 后关闭真空泵。7.3 滤膜培养用无菌镊子夹住滤膜边缘从过滤器中取出，转移到改良霉菌培养基中，将网格面朝上，先将滤膜一边接触培养基后再缓慢下放，使二者紧密贴合，中间不能有气泡。盖好皿盖后将培养皿倒扣放入培养箱中，于 281 培养 24 3 h。7.4 菌落计数用镊子从改良霉菌培养基中取出滤膜，将网格面朝上转移到含有 1.5 mL 荧光显色液的带垫片培养皿中，盖好皿盖后将培养皿倒扣放入培养箱中，于 281 培养 30 min，然后打开皿盖将培养皿口朝上置于紫外检测器中，按说明书操作仪器对荧光菌落计数。8 结果计算与报告8.1 结果计算选取菌落数在 10 CFU-150 CFU 的平板进行计算，将同一稀释度的两个平板菌落数取平均值，再乘以相应的稀释倍数，以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示霉菌的总数。 8.1.1 若两个连续稀释度的所有平板菌落数均在 10 CFU-150 CFU 之间，按如下公式计算：dnC21.0N式中：N 样品菌落数；c两个连续稀释度的所有平板菌落数之和；n1低稀释倍数平板个数；n2高稀释倍数平板个数；d低稀释度稀释因子示例：稀释度 1:100 （低稀释度） 1:1000 （高稀释度）菌落数（CFU ） 132/126 16/18XX/T XXXXXXXXX427130.912.08613.0N21 dnC按 8.2.2 数字修约后，表示为1.310 4。8.1.2 若所有平板上的菌落数均小于 10 CFU，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。8.1.3 若所有平板上的菌落数均大于 150 CFU，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数计算。8.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均不在 10 CFU-150 CFU 之间，其中一部分小于 10 CFU 或大于 150 CFU 时，则以接近 10 CFU 或 150 CFU 的平均菌落数乘以相应稀释倍数计算。8.1.5 若所有稀释度的平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。8.1.6 若所有稀释度的平板菌落数多不可计，则需重复实验，选取更高稀释度的样品稀释液计数。8.2 报告8.2.1 菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。8.2.2 菌落数大于或等于 100 CFU 时，第三位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前 2 位数字，后面用 0 代替位数或者用 10 的指数形式来表示。 8.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。8.2.4 最终以 CFU/g 为单位报告。9 废弃物处理检测过程中的废弃物按照 GB 19489 的相关要求进行处理。XX/T XXXXXXXXX5A A附 录 A（规范性附录）培养基和试剂A.1 成分A.1.1 麦芽浸粉：30.0 g。A.1.2 葡萄糖：20.0 g。A.1.3 大豆蛋白胨：5.0 g。A.1.4 酵母粉：2.0 g。A.1.5 磷酸二氢钾：1.0 g。A.1.6 硫酸镁：0.5 g。 A.1.7 琼脂：20.0 g。A.1.8 维生素B 2：0.005g。A.1.9 氯霉素：0.1 g。A.1.10 蒸馏水：1 000 mL。 A.2 培养基的制备除琼脂外，将各成分定量加入 1500 mL 烧杯中，加入适量蒸馏水，搅拌至完全溶解，补足蒸馏水至 1 000 mL， 摇匀。用 500 mL 广口三角瓶分装成 2 份，按比例加入琼脂，于 121 灭菌 15 min 后安全取出，倾注 15 mL -20 mL 至每个无菌平皿中盖好，待冷却凝固后置 4 冰箱内保存备用（储存时间不宜超过 2 周）。_