基因组学与蛋白质组学 ppt课件

基因组学与蛋白质组学,Genomics and Proteome,1,基因组 （Genomics）指一个生物体、细胞或病毒的全部遗传物质,2,几个代表物种的基因组大小,3,一、人类基因组计划的启动 1986 年诺贝尔奖获得者R.Dulbecco（杜尔贝科）提出人类基因组计划 测出人类全套基因组的 DNA 碱基序列（ 3 X 109 bp ）,4,1975年，获诺贝尔生理医学奖,5,6,美国政府决定于1990年正式启动HGP，预计用 15年时间，投入30亿美元，完成HGP。 由国立卫生研究院和能源部共同组成“人类基因组研究所” 逐渐地，HGP扩展为多国协作计划。参与者包括：英、日、法、德和中国（1993年）,7,二、人类基因组计划的进展状况 （1）截至 1998 年 10 月，完成 1.8 X 108bp，占 计划的 6。 （2）完成一系列模式生物全基因组测定。 这些模式生物全基因组测定的完成有重大理论与现实意义。,8,（3）DNA 测序技术飞速提高 1998.5.9 J.C. Venter 等宣布，组建商 业公司，投入 3 亿美元，3 年内完成。,接着又有若干家公司成立，共投入资金约几十亿美元，形成“公”“私”并进 格局,9,2000.6 完成并公布 人类基因组工作框架图( 90%)。,10,二000年六月二十六日克林顿宣布 人类基因组草图绘制完成,11,美国国家人类基因组研究所所长弗朗西斯柯林斯在介绍情况。,12,人类基因组草图基本信息,由31.65亿bp组成 含33.5万基因 与蛋白质合成有关的基因占2%,人类基因组,13,2000年6月公共领域测序计划工作框架图,14,2000 年 12 月美、英等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱，这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。,15,2001 年2月16日人类基因组“精细图”完成，(99%),16,同时发表论文 美国 Science, Vol. 291, No. 5507 英国Nature , Vol.409, p.860,17,DAN测序胶图,18,年月日，人类基因组序列图亦称“完成图”（99.99%），提前绘制成功。,19,第一节 基因组学,Genomics,20,一、基因组学,基因组学（Genomics）阐明基因组的结构、探讨结构与功能的关系以及基因与基因之间相互作用的科学。包括：,结构基因组学 （structural genomics） 功能基因组学 (functional genomics) 比较基因组学 (comparative genomics),21,基因组学包括3个不同的亚领域 结构基因组学(structural genomics) 功能基因组学(functional genomics) 比较基因组学(comparative genomics),基因组学概念,22,二、结构基因组学,结构基因组（structure genomics）以生物体全基因组的结构为研究对象，对其进行分区和标记，使之成为比较容易操作的小的结构区域，确定染色体基因组全部DNA序列、各基因所在的位置以及结构与功能的关系，为阐明基因功能奠定基础。,23,（一）结构基因组主要内容,通过基因作图、序列分析及基因鉴定，建立具有高分辨率的生物遗传图谱、物理图谱、转录图谱和序列图谱。,24,、 遗传图谱（genetic map）指基因或DNA标记在染色体上的相对位置与遗传距离。cM（基因或DAN片段在染色体交换过程中分离的频率）,25,多态性：人的DNA序列上平均每几百个碱基会出现一些变异（variation），并按照孟德尔遗传规律由亲代传给子代，从而在不同个体间表现出不同，因而被称为多态性（Polymorphism）。,26,第一代多态性标记是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性）,27,28,第二代多态性标记是短的串联重复序列（short tandem repeats, STR）包括小卫星DNA和微卫星DNA (microsatellite sequence, MS)，其多态性主要来自重复序列拷贝数的变化,29,小卫星DNA由15-65bp的基本单位串联重复而成，长度一般不超过20kb。 重复次数（小卫星DNA区的长度）在人群中是高度变异的；按照孟德尔的规律遗传,微卫星DNA/简短串联重复（STR、STRP或SSLP） 重复单元2-8bp，通常重复10-60次,CTAGCTTATATATATATATATATATATATAAGCTTGC,30,第三代多态性标记是单核苷酸的多态性 （single nucleotide polymorphism，SNP）,31,人类999的基因密码是相同的，而差异不到01，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“单一核苷酸多样性”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础。在整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一，从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区别。,32,遗传图谱的缺陷,分别率有限人类只能研究少数减数分裂事件，不能获得大量子代个体测序要求每个标记的间隔小于100kb实际是599kb,33,遗传图谱的缺陷,精确性不够 经典遗传学认为，交换是随机发生的 基因组中有些区域是重组热点 倒位、重复等染色体结构变异会限制交换重组,34,2、物理图以已知核苷酸序列的DNA片段（序列标签位点，sequence-tagged site,STS）为“路标”，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图。,35,酵母遗传图与物理图比较,A 遗传图 B 物理图,36,3、转录图谱 （transcription map）以EST（expressed sequence tag ，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。,EST：通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行测序所获得的部分cDNA的5或3端序列称为表达序列标签（EST），一般长300-500bp左右。,37,4、序列图（分子水平的物理图）（sequence map）序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，也是最详尽的物理图。1m既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。,38,脉冲场琼脂糖凝胶电泳； 毛细管电泳； 基因芯片技术； 全基因组随即测序 。,（二）结构基因组研究常用的方法,39,CREDIT: JOE SUTLIFF,Science, Vol 291: 1221.,Fishing in a More Effective Way!,40,基因组测序策略,有了高密度的基因组图谱，就可以开始全基因组测序了 测序的技术飞速发展，现在可以全自动化 测序的策略有两个：鸟枪法克隆重叠群法,41,鸟枪法（shotgun sequencing）,42,鸟枪法的优缺点,优点：不需要高密度的图谱速度快、简单、成本低 缺点：拼接组装困难，尤其在重复序列多的区域主要用于重复序列少、相对简单的原核生物基因组,43,克隆重叠群法（clone contig）,将基因组DNA切割长度为0.1Mb1Mb的大片段，克隆到YAC或BAC载体上然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列再装配、连接成连续的DNA分子。这是一种自上而下（up to down）的测序策略 clone-by-clone method,44,两种基因组测序策略,45,三、 功能基因组学,完成基因组测序，仅仅是基因组计划的第一步，更重要的工作在于弄清楚：基因组序列中所包含的全部遗传信息是什么；基因组作为一个整体如何行使功能。就是对基因组序列进行诠释的过程，也就是功能基因组学的研究内容。,46,功能基因组学 （functional genomics）根据结构基因组学的研究结果，所提供的基因结构相关信息，采用分子生物学、生物化学和生物信息学的理论和技术，全面、系统地研究基因组中所以基因功能的学科。,47,根据序列分析搜寻基因,查找开放阅读框（open reading frame, ORF）开放阅读框都有一个起始密码子，ATG，还要有终止密码子。从ATG开始，然后向下游寻找终止密码子。起始密码子和终止密码子之间的碱基数目要能够被3整除每一条链都有3种可能的阅读框，2条连共计有6种可能的阅读框.计算机可以很快给出结果。,48,同源查询,利用已经存入数据库的基因序列与待查的基因组序列比对，从中查找可以与之匹配的碱基序列及其比例，用于界定基因。同源查询可以部分弥补ORF扫描的不足。,49,同源查询的依据,有亲缘关系的物种，基因组可能存在某种程度的相似性：存在某些完全相同的序列；ORF的排列相似，如等长的外显子；ORF指令的氨基酸序列相似；模拟的多肽链的高级结构相似，等。,50,基因功能研究,1、计算机预测基因功能 依据仍然是同源性比较。同源基因拥有一个共同的祖先基因，它们之间有许多相似的序列。 种间同源基因 种内同源基因,51,基因功能研究,2、实验确认基因功能 基因克隆基因敲除（knock-out）基因的超表达反义RNA技术RNAi转座子插入突变,52,什么是比较基因组学？,利用生物在进化上的亲缘关系,来比较它们与人类之间的相似与相异,即比较基因组学。,53,54,基本完成DNA序列分析的真核生物基因组比较,55,反义RNA（antisense RNA）技术,56,小 结,转录组,蛋白质组,57,58,59,第二节 蛋白质组学,Genomics,60,* 蛋白组（Proteome）蛋白质组是指一种生物体产生的全部蛋白质。 * 蛋白组学（Proteomics）以蛋白质组委研究对象、研究细胞内各种蛋白质的组成、表达及其规律的学科。,61,1.蛋白质分离和鉴定： 2.翻译后修饰：翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。 3.蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。 4.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。,蛋白质组学的研究内容,62,蛋白质组研究更为复杂和困难：蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质随时间和空间而变化。,63,发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。,当前主要任务,64,二、蛋白质组的研究方法,65,研究蛋白质组的组成成分 支撑技术主要有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学分析。,蛋白质组表达模式（expression profile）：,66,（一）蛋白质组研究中的样品制备,通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。,67,样品预分级的主要方法,蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等,68,样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。,69,组织水平上的蛋白质组样品制备,临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。,70,激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM),可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。,71,（二）蛋白质组研究中的样品分离,双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。,72,原 理,第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF), 再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。 1975年首先由OFarrell等创立。,73,特 点,可分离10100 kD分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配,74,第一向IEF电泳,传统OFarrell系统双向电泳的缺陷。 Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯度等电聚焦技术，Grg等成功地将之应用于双向电泳。优点,75,固相pH梯度等电聚焦的优点,克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。,76,第二向SDS-PAGE电泳,垂直板电泳水平超薄胶电泳,77,2-DE技术的缺点,极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。,78,新型非凝胶技术,液相色谱法 liquid chromatography，LC 毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE,79,液质联用技术（LC-MS/MS）,蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。,80,根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。,多维色谱技术（LC/LC-MS/MS）,多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology),81,（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定,传统方法：蛋白质微量测序氨基酸组成分析,82,新型蛋白质鉴定技术 质谱（MS）法,基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。,83,“软电离”的特点,分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。 灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、既可定性又可定量、并能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。,84,基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）,主要质谱类型,85,鉴定和注释蛋白质的路线,通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配 通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配,86,目 录,87,仪 器,MALDI-TOF质谱仪：灵敏度高（可达fmol），分析速度快，谱图简单易于解析以及受缓冲液、盐份的干扰小,88,肽质谱指纹图在数据库中匹配 不成功的可能原因,样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质量不好。 2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图。,89,操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载 所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白质 数据库规模太小,续：,90,组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF） 傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）,联合技术精确鉴定蛋白质,91,（1）原理：将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。,3 酵母双杂交系统,92,双杂交系统的原理,LacZ,Gal4激活域,Gal4结合域,Gal4结合域,LacZ,LacZ,Gal4激活域,LacZ,Gal4激活域,Gal4结合域,X,Y,X,Y,93,一、酵母双杂交系统,酵母激活因子 GAL4：N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)， C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。组成部分：（1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；（2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白（prey）；（3）带由一个或多个报告基因的宿主菌株。,94,Yeast Two Hybrid原理,BD,X,COOH,AD,cDNA,NH2,COOH,共转化,+,BD,X,?,AD,Gal4,Gal4,Promoter,Reporter,Trp-,Leu-,cDNA library,NH2,Gal4,Gal4,95,酵母双杂交系统的优点,采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达，并且避免蛋白质纯化过程 检测在活细胞内进行，体现真核细胞内真实情况 可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用 可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库 易于转化、便于回收扩增质粒 具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合,96,酵母双杂交系统的应用,检测已知蛋白质之间的相互作用 确定蛋白质作用功能区域位点 确定未知蛋白质之间的相互作用 确定基因治疗中多肽类药物的作用机理,97,酵母双杂交系统的局限性,检测定位于细胞核内的蛋白质间相互作用 “假阳性” ：某些蛋白本身具有激活转录功能 融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能 “假阴性”：不利于核外蛋白研究,98,酵母双杂交的实验流程,构建诱饵质粒（X-BD) 将质粒转化酵母菌 检测X-BD蛋白在酵母中的表达通过酵母生长曲线检测X-BD是否有毒性进行自激活测试,99,将文库质粒共转化入X-BD-酵母筛选阳性克隆子（四缺，x-gal显色反应）共转化再次确认相互作用将阳性克隆子在二缺平板上划线3次提取酵母质粒，转化E.coli，提取质粒PCR或双酶切去除含有相同长度cDNA的克隆子DNA测序NCBI数据库搜索,100,酵母双杂交基本过程,101,1）已知蛋白之间相互作用的检测： 2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸； 3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。,用途,102,4 蛋白质芯片,其制作原理类似于基因芯片，所不同的是，蛋白、多肽芯片所用的样品是提纯的蛋白、多肽。其检测的原理类似于抗原、抗体检测的ELISA法。如采用双抗夹心的形式，可通过机械点涂的方法，将多种不同的单克隆抗体点样固定在固相介质表面，如PVDF膜上，制备成抗体蛋白芯片，与制备的多种抗原样本杂交、结合，芯片上的抗体捕获相应的抗原，然后再与标记的多种不同的抗体杂交，由于抗原具有多价结合表位而结合标记抗体，根据杂交信号的有无、多少而进行定性、定量的分析。,103,