微生物的生长繁殖PPT课件

微生物的生长繁殖 及其控制,1,第一节 微生物的个体生长,生长：生物个体组成物质有规律地增加，导致个体 体积增大、重量增加的生物学过程。,繁殖：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的 生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。,生长是一个逐步发生的量变过程， 繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。,在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单 细胞的生物里，由于细胞小，这两个过程是紧密联系又很难划 分的过程。,2,群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,个体生长 个体繁殖 群体生长,在微生物学中提到的“生长”，一般都指群体生长，这一点与 研究大生物时有所不同。 在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）,3,4,微生物个体生长的测定,微生物生长的测定：,个体计数 群体重量测定 群体生理指标测定,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,5,（一）计数法,可用于测定细菌、酵母菌等单细胞微生物 以及放线菌、霉菌的孢子计数,1.显微镜下的 直接计数法,血球计数板法,2.间接计数法 -活菌计数法,1.平板菌落计数法 2.膜过滤培养法,6,1、显微镜直接计数法,缺点：不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,7,2、平板菌落计数法,8,一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而 不是直接表示为细胞数。,9,3、膜过滤培养法,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样 品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形 成的菌落进行统计。,10,4、其它方法：,将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细胞浓度的样品混匀 后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。,比例计数：,过滤计数：,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品 通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显 微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数；,活菌计数：,采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数,11,（二）生物量测定法,1、比浊法,在一定波长下，测定菌悬液的光密 度，以光密度(optical density, 即O.D.)表示菌量。,实验测量时应控制在菌浓度与光密度 成正比的线性范围内，否则不准确。,12,2、重量法,以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；,测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法,通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算 微生物群体的生物量；,13,3、 生理指标法,微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、 生物热等与其群体的规模成正相关。样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显， 因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量 热计等设备来测定相应的指标。,常用于对微生物的快速鉴定与检测,14,15,第二节 细菌的群体生长繁殖,微生物的特点：,个体微小,肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个 单个的微生物组成的群体。,微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长,对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础,16,一、生长的规律,生长曲线(Growth Curve)：,细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,17,18,一、生长曲线,一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期,19,一、生长曲线,迟缓期(Lag phase)：,将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。,20,迟缓期的特点：,分裂迟缓、代谢活跃,细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞 体积最大细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、 酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。,细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。,21,迟缓期出现的原因：,微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶， 或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢 产物，就需要一段适应期,调整代谢,迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境 条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。,在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：,(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；,(2)利用对数生长期的细胞作为种子；,(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；,(4)适当扩大接种量,22,对数生长期(Log phase)：,又称指数生长期(Exponential phase) 以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加， 细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。 对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长 迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作 种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。,23,t1 t0 0.639 G = = n m m：比生长速率,在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖 一代所需的时间为代时(Generation time) ，在群体生长里细菌数量增加一倍所需 的时间称为倍增时间（Doubling time)。代时通常以G表示。,24,影响微生物增代时间（代时）的因素：,1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；,2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短,3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比，,凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。,4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。,25,稳定生长期(Stationary phase)：,由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜 于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等 于细菌死亡数)。,26,稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数 最高并维持稳定。,1、是细胞重要的分化调节阶段,储存糖原等细胞质内含物，芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等。 2、是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。 3、是以细胞生产为目的的最适收获阶段.,27,衰亡期(Decline或Death phase)：,营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生 速率，整个群体呈现出负增长。 该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分 细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。,28,衰亡期细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。,29,图3：羊耳菊提取物对甲型副伤寒沙门氏菌的杀菌曲线,Fig. 3: Time-bactericidal curves of extracts of Inula cappa against Salmonella paratyphi A,羊耳菊提取物抑菌效果的研究 刘胜贵1,2，陈富成1，李军1，邓乐2 (1.怀化学院生命科学系；2.湖南师范大学生命科学学院),30,二、同步培养,同步培养(Synchronous culture)：,使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶 段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。,以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时 进行分裂的生长。,同步生长：,通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物,31,同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传 特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。,机械方法,离心方法 过滤分离法 硝酸纤维素滤膜法,环境条件控制技术,温度 培养基成份控制 其他（如光照和黑暗交替培养）,32,硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法,由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代， 随后又逐渐转变为随机生长。,细胞结合于硝酸纤维素滤膜上,倒转硝酸纤维素滤膜,分部收集同步生长细胞,33,三、分批培养,将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获,培养基一次加入，不予补充，不再更换。,典型的生长曲线反映的是分批培养（batch culture）or 封闭培养（closed culture）时的生长规律,34,四、连续培养(Continous culture ）,在分批培养达到对数期的后期时，采取不断的补充营养物质和以 同样的速率移出培养物的措施，达到一种动态平衡，使微生物能 以恒定的比生长速率生长并能继续生长下去。,培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是 实现微生物连续培养的基本原则。,我们的期望:长期保持对数生长期的平衡生长状态,35,根据控制方式不同可分为,恒浊连续培养,不断调节流速而使细菌培养液 浊度保持恒定,恒化连续培养,保持恒定的流速,36,（一）恒浊连续培养,一般用于菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业,（连续发酵）,连续发酵与单批发酵相比的优点：,缩短发酵周期，提高设备利用率； 便于自动控制； 降低动力消耗及体力劳动强度； 产品质量较稳定；,缺点：杂菌污染和菌种退化,37,二）恒化连续培养,使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高 生长速率下进行生长繁殖。,38,第三节 微生物生长繁殖的控制,抑制(Inhibition)：生长停止，但不死亡；,防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长,化疗(Chemotherapy)：杀死或抑制宿主体内的病原微生物；,消毒(Disinfection)：杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）；,灭菌(Sterilization)：杀死包括芽孢在内的所有微生物；,39,理化因子抑菌还是杀菌作用的相关因素：,理化因子的强度或浓度； 同一浓度理化因子作用时间的长短； 不同种类的微生物； 同种微生物的不同生长时期；,40,一、控制微生物的化学物质,抗微生物剂(Antimicrobial agent),生物合成的天然产物,人工合成的化合物,一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质,41,1 抑菌圈（zone of inhibition）试验,化学物质的抗微 生物能力的测定,42,化学物质的抗微 生物能力的测定,2 最低抑制浓度实验 （minimum inhibitory concentration（MIC）,43,抗微生物剂,抑菌：,抑菌剂(Bacteriostatic agent),杀菌,杀菌剂(Bactericide),溶菌剂(Bacteriolysis),待测化学物质 对数生长培养物定时测定总菌数和活菌数,44,抗微生物剂,非选择性 （对所有细胞均有毒性）,有选择性 （对病原微生物毒性更强）,消毒剂(Disinfectant),防腐剂(Antisepsis),抗代谢药物,抗生素,中草药有效成分,（化学治疗剂）,45,（一）防腐剂和消毒剂,消毒剂：可杀死微生物，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。,防腐剂：能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。,46,各种抗微生物化学制剂杀菌能力的比较标准：,石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度 和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为 10分钟，而供试菌定为Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）。,在临床上最早使用的消毒剂-石炭酸,47,磺胺是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物,作用机理：,磺胺的抑菌作用是因为很多细菌需要自己合成叶酸而生长。,磺胺对人体细胞无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的 相关酶-二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行 合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。,48,磺胺药物是是最常见的化学疗剂，抗菌谱广， 能治疗多种传染性疾病。,大多数革兰氏阳性细菌（如肺炎球菌、溶血性链球菌等） 某些革兰氏阴性细菌（如痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等） 对放线菌也有一定的作用。,49,The Development of Chemotherapy,Trypan red (Ehrlich,1904),Arsphenamine (Ehrlich,Sahachiro Hata,1910),Prontosil Red (Domagk,1935),Sulfanilamide (Jacques,1935),Penicillin (Fleming,1929),Streptomycin (Waksman,1944),Penicillin (Florey,Chain,1939),50,（二）抗代谢物,有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以 和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行 ，这些物质称为抗代谢物(Antimetabolite)。,叶酸对抗物（磺胺）、嘌呤对抗物（6-巯基嘌呤）、苯丙氨酸对抗物（对氟苯丙氨酸）、尿嘧啶对抗物（5-氟尿嘧啶）胸腺嘧啶对抗物（5-溴胸腺嘧啶）等等,51,（三）抗生素,是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物， 它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动，如 杀死微生物或抑制其生长。,抗生素(Antibiotic)：,1、概念,自本世纪40年代以来，已找到上万种新抗生素，合成了近10万 种半合成抗生素，但其中在临床上常用的仅几十种。,52,2、作用机制,抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、抑制蛋白质和核酸合成 等,抑制微生物的生长或杀死它们,53,54,55,2、作用机制,56,57,青霉素b-内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构相似，从而能占据 D-丙氨酸的位置与转肽酶结合，并将酶灭活，肽链之间无法彼 此连接，抑制了细胞壁的合成。,58,由于不同微生物之间的细胞化学结构和代谢的差异，不同的 抗生素的抗菌谱各异。,59,青霉素的使用，这标志着抗生素时代的到来，它使人类的平均寿命延长了15年以上。但是，随着青霉素的广泛应用，发现了耐药菌的产生。1941年用2万单位青霉素能够控制的感染逐步上升到用20万、100万甚至更高的单位才能控制，人们第一次把细菌耐药性的问题提到重要的日程。,3、细菌抗药性的产生,随着更多的抗生素特别是第二代和第三代头孢菌素的广泛使用，产生了甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(methi cillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，它对许多抗生素产生耐药性。细菌耐药性问题又被第二次提到了重要的日程。,60,1992年美国13 000人死于耐药菌的感染， 1995年在临床发现的葡萄球菌有96是耐药菌，1998年60万耐药菌感染病人的医疗费增加370万美元。我国的有关资料表明，1998年的MRSA出现频率比 1996年高3倍，青霉素耐药肺炎链球菌(penicillin resistant Streptococcus pneumoniae，PRSP)的出现频率高达30。一度被认为不治之症的结核病曾用链霉素治愈，后来出现的一些耐药菌又被随之开发的利福平类治愈，但近年来出现的对这些药物都产生耐药性的结核分枝杆菌令人担忧。这些耐药菌成为临床医生难以对付的“超级细菌”。,61,细菌耐药性是21世纪全球关注的热点，它对人类生命健康所构成的威胁绝不亚于艾滋病、癌症和心血管疾病。战胜细菌耐药性的途径：一是要制定一系列的措施，防止由于滥用抗生素而造成耐药菌的快速和广泛地出现；二是要根据细菌产生耐药性的作用机制，不断研究开发新的抗菌药物，有效地控制日益严重的耐药菌感染的问题。,62,细菌耐药的主要机制,灭活酶产生,抗生素靶位点改变 孔蛋白改变，细胞壁/膜通透性改变,63,避免出现细菌的耐药性的措施：,(1)第一次使用的药物剂量要足； (2)避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素； (3)不同的抗生素(或与其他药物)混合使用； (4)对现有抗生素进行改造； (5)筛选新的更有效的抗生素；,64,65,二、控制微生物的物理因素,杀灭或抑制微生物的物理因素,温度 辐射作用 过滤 渗透压 干燥 超声波等,66,（一）温度,当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对 微生物产生杀灭作用或抑制作用,67,（一）温度,高温使蛋白质、核酸 等重要生物大分子发 生变性、破坏，以及 破坏细胞膜上的类脂 成分，导致微生物死亡。,温度愈高，十倍致死时间愈短,68,高温的杀菌时间与样品中 的微生物浓度有关。,当微生物的浓度一致时， 可以通过比较热致死时间 长短来衡量不同微生物的 热敏感性。,69,1、干热灭菌,烘箱内热空气灭菌火焰灼烧,干热灭菌,160，2小时,70,2、湿热灭菌,湿热比干热灭菌更好：,更易于传递热量； 更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构；,湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：,多数细菌和真菌的营养细胞：在60左右处理5-10分钟； 酵母菌和真菌的孢子：用80以上温度处理； 细菌的芽孢：121处理15分钟以上；,71,第三节 微生物生长繁殖的控制,二、控制微生物的物理因素,（一）温度,2、湿热灭菌,1）巴斯德消毒（pasteurization）,60-85处理15秒至30分钟,2）煮沸消毒,3）间歇灭菌（fractional sterilization OR tyndallization）,4）常规高压灭菌（autoclaving）,5）连续加压灭菌（continuous autoclaving ）,121，15分钟； 115，30分钟；,135-150，5-15秒，工业上发酵培养基 135-150，2-6秒，牛奶或其它液态食品,（超高温灭菌）,72,（二） 辐射作用,辐射灭菌(Radiation Sterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波 杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。,用于灭菌的电磁波有微波，紫外线(UV)、X-射线和-射线等,73,