临床基因扩增标本的留取及核酸提取方法ppt课件

临床基因扩增标本的留取及核酸提取方法,1,2,3,九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测,1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次成功实验发明了PCR 1985 关于PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事等人 在Science上 发 表 1989 12月Science杂志将PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry,1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术,4,循环次数 DNA的链数1 21 22 22 43 23 810 210 102420 220 1,048,57630 230 1,073,741,824 10亿,PCR循环次数与DNA产量关系,PCR循环,PCR特点：高效扩增、忠实复制,5,灵敏度高 快捷 简便 对样品纯度要求低 可以相对定量,PCR反应的特点,6,Ct值的意义,Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次扩增,FQ-PCR,Ct值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同,7,感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 法医学鉴定,荧光定量PCR的临床应用,8,早期诊断 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证,9,一 感染性疾病1. 病原体含量与病情之间的关系2. 病原体含量与用药之间的关系3. 药物及疗法的研究与开发4. 新的病原体分子诊断标准5. 新的愈后指标6. 传染病发病的监控、预测与预防,临床应用,10,临床应用,二 肿瘤 1. 肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等 2. 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因,11,三 遗传病 1. 等位基因检测 2. 多基因遗传病的突变检测 3. 基因表达异常所致遗传病检测,12,荧光定量PCR在病原体检测中的应用,一 肝炎病毒定量检测 二 性病病原体检测 三 结核杆菌及呼吸道病原体检测 四 优生优育(TORCH)相关项目检测,临床应用,13,肝炎病毒定量检测 HBV HCV,临床应用,14,（一） 乙型肝炎病毒结构及特点,HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中 HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好,HBV,15,HBV,（二） HBV-DNA与“两对半”,1. “两对半” ：机体的免疫反应状态；,2. “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。,FQ-PCR：检测的是HBV本身的遗传物质DNA，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。,16,3. 血清学指标()不能排除HBV感染。,HBV,（二） HBV-DNA与“两对半”,4. 也可能出现HBsAg()，HBV-DNA()。,5. HBsAb () 、 HBcAb () 、 HBeAb ()三抗体阳性 与HBV DNA 2.5 103 copy /ml 结果解释。,17,HBV,(三) HBV-DNA定量检测的临床意义,3. HBV-DNA定量与预后a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌变的几率明显高于含量低者,1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性,2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效a. 专家提出103 copy /ml做为阴性或临床治愈标准b. HBV-DNA定量分析与干扰素治疗(前、中、后)c. 拉咪呋啶,18,HBV感染与干扰素治疗,治疗前：a: 治疗前HBV低水平复制者对干扰素的反应性明 显优于高水平复制者。b: 治疗前HBV DNA 含量特别高者大多没有疗效。c: HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV DNA 含量较低者。,19,HBV感染与干扰素治疗,治疗中：a: 病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。b: 相反，治疗期间HBV DNA复制水平下降较慢， 或下降幅度较小，或者变化不明显者，大多是 干扰素治疗无效。,20,HBV感染与干扰素治疗,治疗后：a: 治疗结束后，采用PCR定量法检测，HBV DNA 103 copy/ml 者，可能不再复发。b: 终止治疗后HBV DNA 仍保持较低水平者， 反跳的可能性较大。,21,Poor Response to IFN Therapy,CHRONIC HEPATITIS B,22,拉咪呋啶：有显著降低高病毒载量作用，近期疗效颇有优势，但是长期使用可导致HBV变异，患者易出现耐受性，而且容易出现停药后反弹。,HBV感染与拉咪呋啶治疗,23,拉米夫定抑制血清HBV DNA,24,HBV,(三) HBV-DNA定量检测的临床意义,4. HBV-DNA定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查,6. 血液制品和献血员的筛选,25,病毒特点：1. 单正链RNA病毒2. E1和E2区基因高度变异性,（一）丙型肝炎病毒特点,HCV,感染特点： HCV在血中含量极微 输血后肝炎主要致病因子 免疫学标志仅有抗-HCV，非中和抗体，产生时间不一 有一部分人感染HCV后，不产生抗-HCV 感染易于慢性化(50-85%) 疫苗研制尚不成功,单链RNA,26,(二) HCV-RNA定量检测的临床意义,1. 早期诊断a. 临床以 80 copy/ml做为无感染或治愈标准。b. HCV感染1-3W，即可检出HCV-RNA的存在。c. 严格筛选献血员 ,提高对窗口期感染者的检出率。d. 医疗纠纷中的“举证倒置”，病人入院前后进行HCV-RNA检测。,HCV,27,HCV,(二) HCV-RNA定量检测的临床意义,2. HCV-RNA载量与抗-HCV滴度、ALT水平之间的相关性。抗-HCV滴度和ALT异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。,3. HCV-RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标。,4. 慢性丙型肝炎长期抗-HCV阳性，这时如果进行HCV-RNA 定量检测可以鉴别活动性、复制程度。,28,二 常见性传播疾病病原体,一 淋球菌（NGH） 二 沙眼衣原体（ CT ） 三 解脲脲原体（UU） 四 梅毒螺旋体（TP） 五 单纯庖疹病毒（HSV） 六 乳头瘤病毒（HPV） 七 人类免疫缺陷病毒（HIV） 八 EV71 A16 通用型,STD,29,艾滋病,艾滋病是英文AIDS（Acquired Immunity Deficiency Syndrome) 的中文译音，全称是“获得性免疫缺陷综合征”。它可以由人类免疫缺陷病毒（HIV,Human-being Immunity Deficiency Virus ），又称艾滋病病毒引起的疾病。当病毒侵入人体后，经一段时间的潜伏期，破坏人体的免疫力，从而发病，病死率高，是一种严重的传染病。,30,艾滋病是一种有明确病原体的可通过人之间一定传播途径传播的慢性传染病，属于传染病防治法中规定的乙类传染病,31,HIV病毒：多亚型和多变异,HIV-1和HIV-2 M组、O组和N组 亚性型：A-K CRF：基因重组亚型，主要是HIV-1型 毒株亚型监测的意义不同亚型与不同传播途径的关系：B主要通过男性同性性行为和静脉注射吸毒传播，C主要异性性接触传播流行地理和传播线路的分析：东南亚区域的C亚型和B亚型重组亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的B/A重组流行、泰国的A/E重组,32,艾滋病病毒在外界的抵抗力,HIV病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力很快消失HIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙型肝炎病毒（HBV）的抵抗力低得多对HBV有效得消毒和灭活方法均适用于HIV,33,典型进展者：8-10年潜伏期后成为艾滋病人，80% -90%快速进展者：CD4细胞2-5年内迅速下降，HIV病毒载量一直维持较高水平，而且分离的HIV有均一性。长期存活者（又称长期不进展者）：维持15年以上，而且CD4计数维持正常，在所有感染者中比例一般在8%-10%。,HIV感染的三种结局,34,艾滋病的诊断,HIV感染者：确定HIV感染的个体抗体检测：初筛和确认辅助诊断艾滋病病人：临床诊断标准见国家标准HIV/AIDS的诊断标准和防治原则GB16000-1995,35,荧光定量PCR的应用为艾滋病的初筛和辅助检查提供了有力的工具,36,NGH,淋球菌感染与致病,1. 人是淋球菌的惟一宿主。,2. 发病率最高，在所STD疾病中，高达60%左右。,3. 发病趋势：a. 男性多于女性。b. 城市走向农村，c. 高收入阶层向低收入阶层扩展,4. 人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。,5. 如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎,37,CT,沙眼衣原体感染与致病,1. 严格的细胞内寄生。,2. 不仅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要病原体。,3. 近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居STD之首。,4. 在我国，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。,5. 泌尿生殖道感染，妨碍妊娠。,6. 盆腔感染，可致生殖能力损害。,38,UU,解脲脲原体感染与致病,合成尿素酶，分解尿素,2. 在非淋球菌性尿道炎其感染率仅次于衣原 体感染，居第二位。,3. 流产超过4次以上者，检出率高达80%。,4. 有30-40%男性尿道炎是由感染UU所致。,5. 与男性不育相关。男性不育患者精液中，脲原体检出率高达66.6。检出率随精子数减少和精子活动力下降而升高。,39,1. 非培养或形态学检查的诊断技术，快速、特异、敏感。 2. 对无症状或症状轻者，可以早期确诊。 3. 对NGH、CT、UU 等混合感染者，诊断和鉴别诊断。 4. 指导用药、考核疗效。,荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义,NGH/CT/UU,40,NGH/CT/UU,荧光定量PCR诊断NGH/CT/UU的意义,5. 不孕不育、优生优育。 6. 流行病学调查，为性传播疾病的监控提供依据。 7. CT、UU是FDA批准的PCR检测试剂盒，可作为首选 方法，在临床推广应用。,41,人乳头瘤病毒感染与致病,1. HPV具有宿主和组织特异性，只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞，人是HPV的惟一宿主。2. 有100多个型。3. 低危型：HPV 6、11引起良性病变 (尖锐湿疣、喉乳头瘤等),HPV,42,人乳头瘤病毒感染与致病,HPV,4. 高危型：HPV 16、18引起恶性肿瘤 (宫颈癌、 肛门癌、口腔癌等)5. 免疫原性低，易形成持续性感染。6. 新生儿产道感染。,43,HPV,44,1. 对典型病例可以明确诊断。 2. 对临床表现和组织病理改变都不典型的病例同样可以做出诊断。 3. 对亚临床和隐性HPV感染做出诊断。 4. 基因分型。 5. 考核疗效与预后。 6. 病毒载量与患癌症风险。,HPV,荧光定量PCR检测HPV的意义,45,HPV,46,手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）,为全球性传染病，世界大部分地区均有流行的报道。 1957年在加拿大首次报告，新西兰Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出CoxA16，同时患者血清抗体有四倍增长,初步查明CoxA16为本病病原； 1959年提出HFMD命名，HFMD在全球广泛流行，无明显的地域分布。 之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV 71引起的手足口病流行。 发热, 不适, 咽喉肿痛, 口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡 传染性极高 病程约1周,47,HFMD的病原,手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分埃可病毒和柯萨奇B组病毒, 以CoxA16 和 EV71最为常见 传播途径: 粪-口途径传播: 唾液与粪便; 呼吸道传播: 空气飞沫; 接触传播疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。HFMD为全球性传染病，在全球广泛分布，无明显的地域分布, 但 近年EV71在东南亚一带流行, 引起较多的重症和死亡病例。在80年代和90年代，中国手足口病的流行主要以CoxA16为主，2008年，CoxA16 和EV71 共循环引起手 足口病爆发, EV71在大部分省市为优势病毒。,48,人肠道病毒感染的一般致病机制,49,致病特点,隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人易感。 病毒在机体肠道中增殖，很少引起肠道症状，是以消化道为原发灶的全身感染。 不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种人肠道病毒可引起不同临床表现。 感染过程中形成病毒血症。,50,中国HFMD的流行,1981年，我国在上海首次报道了HFMD病例 1987年在中国分离到CVA16 1995年以来，我国陆续在武汉、深圳、上海、重庆、山东和安徽等地的HFMD患者中分离到EV71病毒。 2007年，山东发生了手足口病爆发流行，累计报告HFMD病例39，606例，其中14例病例死亡。实验室检测发现EV71是引起山东临沂HFMD的主要病原，同时还检测到Echo3 和/或 CVA16。 2008年全国出现HFMD爆发流行,以HEV71为优势,CVA16还有其它EV共循环引起,51,加强HFMD病原检测和监测的十分必要,依据台湾1998-2008和中国大陆2007-2008年的经验掌握手足口病病原谱，特别是EV71感染所占的比例，对析 判断HFMD疫情导致重症和死亡的比例有重要的科学参考价值。,52,手足口病的实验室检测,手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合格的临床标本，或无法进行实验室检测。很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD、HEp-2、Vero等，联合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道病毒。,53,病毒实验室检测类型-病毒实验室诊断方法,检测抗体/抗原,检测病毒,检测核酸,ELISA/HI/PA,蛋白印迹,病毒分离,ELISA,电镜,中和试验,RT-PCR,实时荧光定量PCR,套式PCR,LAMP,免疫荧光,基因芯片,每种方法 各有优势, 依据病毒 来定检测策略,New molecular tools for epidemiology studies and diagnosis,54,三 结核杆菌与呼吸道病原体检测,TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia MP：Mycoplasmal pneumonia SARS：severe acute respiratory syndrome H1N1甲型流感 呼吸道合胞病毒,55,结核杆菌流行现状（1）,罗伯特科赫（），德国细菌学家，结核杆菌发现者 结核病是一个全球性的问题，近年来在世界范围内出现流行，且呈增长的趋势,TB,56,结核杆菌流行现状（2）,我国结核病的疫情仅次于印度而居世界第二位 2000年，全国人口结核感染率为44.5%，其中1544岁人群占了53 ，每年约有25万人死于结核病,57,结核杆菌引起的感染,肺部感染：原发性肺结核，开放性肺结核。肺外感染：脑、肾、骨、关节、生殖结核、肠结核、结核性腹膜炎、全身性结核。,58,常规结核病实验室诊断方法及不足,1. 痰涂片作抗酸染色：阳性率低 、费时 2. 细胞培养“金标准”：周期太长(3-4W) 3. 血清学诊断：a. 接种BCG可出现阳性b. 不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人 c. 交叉反应，假阳性 不能早期诊断！容易漏诊、误诊！,TB,59,荧光定量PCR检测TB-DNA的意义,1. 能稳定检测10copy的TB-DNA ，灵敏度高 ，特异性强2. 早期、快速、准确地诊断结核病。痰液、肺及支气管灌洗液肺结核血液播散性结核和各脏器的结核病脑脊液中枢神经系统结核病宫颈拭子、尿道拭子泌尿生殖道结核病,TB,60,3. 荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法。4. TB-DNA浓度可用于判断疗效：痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势 ，TB-DNA拷贝数下降。根据病原体DNA浓度，对药物治疗及疗效观察提供参考依据,TB,荧光定量PCR检测TB-DNA的意义,61,CP、MP感染可致咽炎、支气管炎和肺炎，潜伏期约2-3周，通常起病较缓慢。持续性咳嗽。,肺炎衣原体(CP)、肺炎支原体(MP)感染与致病,CP/MP,MP肺炎约占非细菌性肺炎的1/3以上，或各种原因 引起的肺炎的l0。,MP感染与小儿支气管哮喘密切相关。,CP感染与冠心病存在密切的关系,肺癌、支气管扩张患者中CP感染率相对较高,62,荧光定量PCR用于非典型性肺炎的诊断,意义：1. 直接检测病原体，早期、快速、特异诊断非典 型性肺炎。2. 治疗方案与细菌、病毒感染的治疗方案不同3. 流行病学调查。 TB、MP、CP已被许多医院尤其是妇幼保健医院和儿童医院纳为肺部感染的常规检测项目,MP/CP/SARS,63,甲型H1N1流感,流行性感冒简称流感，是由甲、乙、丙三种流感病毒引起的急性呼吸道传染病。甲型流感病毒根据其表面(H和N)结构及其基因特性的不同又可分成许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素有16个亚型(H1-H16)，神经氨酸酶9个亚型(N1-N9)。,64,“猪流感”更名为“甲型H1N1流感” 世界卫生组织4月30日宣布，从当日起，该组织不再使用“猪流感”一词指代当前疫情，而开始使用“A（H1N1）型流感”一词。与之相对应，我国的官方文件从5月1日起相继用“甲型H1N1流感”代替原来的“人感染猪流感”。 世界卫生组织发言人说，之所以更改叫法，是因为“猪流感”一词容易误导消费者，美国和墨西哥等国的猪肉及猪肉制品已明显受到其他国家进口禁令影响。 世界卫生组织的声明说，根据目前掌握的科学依据，此次流行的病毒仅在人际间传播，尚无证据表明它在猪群内传播，或由猪向人传播，也无证据表明人因食用猪肉或相关产品染病。,65,病 原 学,甲型H1N1流感病毒属于正粘病毒科，典型病毒颗粒呈球状，直径为80 nm120 nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA 和M2蛋白。病毒颗粒内为核衣壳, 呈螺旋状对称, 直径为10nm。甲型H1N1流感病毒为单股负链RNA 病毒，基因组约为13.6 kb，由大小不等的8 个独立片段组成。,66,67,流行病学特点,传染源主要为病猪和携带病毒的猪，感染猪流感病毒的人也被证实可以传播病毒。感染这种病毒的动物均可传播。 传播途径主要为呼吸道传播，也可通过接触感染的猪或其粪便、周围污染的环境或气溶胶等途径传播。某些毒株如H1N1可在人与人之间传播，其传染途径与流感类似，通常是通过感染者咳嗽或打喷嚏等。,68,易感人群普遍易感。患者多数年龄在25岁至45岁之间，目前报道以青壮年为主，应注意老人和儿童。,69,临床表现,潜伏期一般1至7天左右，较流感、禽流感潜伏期长。 人感染甲型H1N1流感后的早期症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。,70,部分患者病情可迅速进展，来势凶猛、突然高热、体温超过39，甚至继发严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克及Reye综合征、呼吸衰竭及多器官损伤，导致死亡。,71,实验室检查,外周血象：白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，并有血小板降低； 血清学诊断：可使用间接ELISA、抗原捕捉ELISA、荧光免疫法等； 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）：由于PCR技术具有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，已用于猪流感病毒基因的检测和分子流行病学调查等；,72,4 病毒分离：从患者呼吸道标本中（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管吸出物、痰或肺组织）分离甲型H1N1流感病毒。常用的方法有鸡胚接种法和细胞培养法。现有的诊断方法中，病毒分离法是较敏感的，但需要2-3周时间。,73,人感染猪流感的诊断标准,医学观察病例：曾到过甲型H1N1流感疫区，或与病猪及甲型H1N1流感患者有密切接触史，1周内出现流感临床表现者。列为医学观察病例者，对其进行7天医学观察（根据病情可以居家或医院隔离）。,74,2 疑似病例：曾到过疫区，或与病猪及甲型H1N1流感患者有密切接触史（也可流行病学史不详），1周内出现流感临床表现，呼吸道分泌物、咽试子、痰液、血清H亚型病毒抗体阳性或核酸检测阳性。,75,临床诊断病例：被诊断为疑似病例，且与其有共同暴露史的人被诊断为确诊病例者。 确诊病例：从呼吸道标本或血清中分离到特定病毒；RT-PCR对上述标本检测，有甲型H1N1病毒RNA存在，经过测序证实，或两次血清抗体滴度4倍升高，可确诊为人感染甲型H1N1流感。,76,四 TORCH感染特点与检测,TOX : Toxoplasma gondii RV: Rubella virus CMV: Human cytomegalovirus HSV: Herpes simplex virus,TORCH,77,TORCH感染特点,1. 母-胎传播的主要病原体 2. 引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因3. 自然状态下呈隐性感染4. 怀孕、多次输血、AIDS等易发生显性感染5. 可致多发性、全身性感染6. 只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防,TORCH,78,(一) 弓形虫感染与致病,滋养体如弓形 ，广泛分布，人兽共患。 寄生在有核细胞中，猫和猫科动物是终宿主 易感者多，免疫者少 我国智力低下儿的弓形虫感染率28 畸形儿的弓形虫抗体IgM阳性率12.25 艾滋病患者约有2080合并弓形虫感染 ，造成艾滋病死亡的一个重要并发病,TORCH TOX,79,人群自然感染率达到60-90%，多为隐性感染 免疫功能低下(怀孕、多次输血、器官移植、AIDS)发生显性感染 可发生垂直传播，是宫内感染和胎儿畸形的主要病毒之一 围生期感染 血、尿、乳汁、精液、分泌物中都可检出病毒,(二) 人巨细胞病毒感染与致病,TORCH-CMV,80,风疹是一种世界性的病毒传染病， 是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一 出疹前1周至出疹后5天均有传染性 人是风疹病毒的唯一宿主 风疹感染后可获得持久的免疫力，临床显性再感染并不多见。,(三) 人风疹病毒感染与致病,TORCH-RV,81,先天性风疹感染往往发生在母体初次感染之时，可致先天性风疹综合症(CRS) 三联症：白内障、耳聋、心脏病。 妊娠时体内皮质类固醇激素的增加以及细胞免疫功能的减弱，这种对正常人无害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影响胎儿。,TORCH-RV,(三) 人风疹病毒感染与致病,82,HSV原发感染多为隐性，大多无临床症状或呈亚临床表现 HSV-1主要引起口唇疱疹，疱疹性结膜炎、脑炎，皮肤性疱疹 HSV-2主要引起原发性生殖器疱疹 (80%) 。 HSV感染后大多数个体不能彻底消灭病毒，也不能阻止复发，病毒以潜伏状态长期存在宿主体内。,TORCH-HSV,(四) 人单纯疱疹病毒感染与致病,83,妊娠期妇女因HSV-1被激活，可通过胎盘感染胎儿，引起胎儿畸形、智力低下、流产等。 围产期感染可引发新生儿疱疹，死亡率高达50%以上。 HSV常与HIV-1同时感染，并能促进病情发展，引起严重的局部和播散性感染。目前认为HSV是一种调节因素，能激活HIV复制 与宫颈癌关系密切。,TORCH-HSV,(四) 人单纯疱疹病毒感染与致病,84,常规TORCH检测方法与不足,组织培养或病原体分离：慢，费力，阳性率低。 血清学诊断： IgG： 人群自然感染率高达60-90%。IgG()不能区别既住感染与现症感染；新生儿IgG()不能说明有感染。IgM： IgM()可能是原发性感染；IgM()不能排除感染。,TORCH,局限性： 1. 不能定量分析2. 抗体的产生受多种因素的影响3. 交叉反应，假阳性,85,荧光探针检测TORCH的优势,原理：直接检测TORCH病原体的核酸 优点：灵敏、快速，特异 意义：早期诊断，妇幼保健、优生优育1. 筛选TORCH患者，提高出生人口素质。 2. 有利于预测胎儿宫内感染状况及妊娠结局。 3. TORCH感染孕妇的治疗效果观察。4. 器官移植、免疫系统疾病等病人监控。5. 建立TORCH的分子诊断标准,TORCH,86,TORCH,TORCH检测核酸与检测标本的比较,87,检验报告单结果读取,3.637E+06 检测下限: 1000拷贝/毫升 3.637106 1.000E+03 copy/ml,如果是标本量是可以定量的，如血液、脑脊液等，则检测结果报告为：copy/ml如果是标本量不能定量，如分泌物等，则结果只能报告为：copy,88,1.亲子鉴定2.法医物证3.PCR-RFLP技术的法医学应用4.罪犯鉴定,法医鉴定,89,免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。,疾病的早期诊断,90,1 乙型肝炎病毒（HBV）; 2. 丙型肝炎病毒（HCV） 3 淋球菌(NGH); 4 人类免疫缺陷病毒（HIV） 5 解脲脲原体(UU) 6 肺炎支原体(MP) 7 单纯疱疹II型 8 人巨细胞病毒（HCMV） 9 人乳头瘤病毒（HPV）6、11 10 高危型人乳头瘤病毒（HPV 8个型） 11 沙眼衣原体(CT) 12 a-地中海贫血 13 结核分支杆菌(TB) 14 新型冠状病毒(SARS),已获证书,91,标本的留取及注意事项,乙型肝炎病毒 HBV-DNA 血清：无菌静脉血2ml注入无菌干燥试管中，室温静止30-60min自然析出血清或1500转离心5min吸取上层血清至1.5ml灭菌离心管 血浆：无菌静脉血2ml，EDTA抗凝 适用于乙肝病毒感染的诊断，正确判断HBV DNA的复制水平，根据病毒载量高低指导用药和药物治疗的疗效监控 丙型肝炎病毒 HCV-RNA 血清，血浆：同HBV 适用于丙型病毒感染的诊断和丙肝病人药物治疗的疗效监控,92,甲型肝炎病毒 HAV-RNA 血清，血浆：同HBV 适用于甲肝病毒感染的辅助诊断 戊型肝炎病毒 HEV-RNA 血清，血浆：同HBV 适用于戊肝病毒感染的辅助诊断 庚型肝炎病毒 HGV-RNA 血清，血浆：同HBV 适用于庚肝病毒感染的辅助诊断,93,乙型肝炎病毒基因分型（RDB技术） 血清，血浆：同HBV 可检测B,C,D三种基因型，为HBV感染的诊断，选择治疗方案和判断预后提供依据 乙型肝炎病毒YMDD基序突变（RDB技术） 血清，血浆：同HBV 检测rtM204和rtL180两个拉米夫定耐药位点，为HBV的药物选择和疗效监控提供依据 乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变（RDB技术） 血清，血浆：同HBV 前C区/BCP区突变可抑制HbeAg表达，此检测帮您正确认识疾病状态和判断预后,94,丙型肝炎病毒基因分型（RDB技术） 血清，血浆：同HBV 适用于定性检测临床血清或血浆样本中人丙型肝炎病毒（HCV）常见基因型别1b，2a，3a，3b和6a，用以指导临床用药 人类免疫缺陷病毒HIV-1-RNA 血清，血浆：同HBV 适用于人类免疫缺陷病毒1型感染的诊断和艾滋病人药物治疗的疗效监控,95,淋球菌NG-DNA 生殖泌尿道分泌物：男性：用细小棉拭子深入尿道约2-4（RDB技术），捻动拭子采集分泌物。（采取前2h禁止小便） 女性生殖道或尿道：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外或尿道口分泌物，再用无菌棉拭子插入，旋动棉拭子采集宫颈分泌物 使用淋球菌感染的诊断，淋菌性与非淋性尿道炎，阴道炎的鉴别诊断，治疗药物的选择及其疗效监控,96,沙眼衣原体CT-DNA 详见NG-DNA检测取样 适用于沙眼衣原体感染的诊断，非淋性尿道炎，阴道炎的鉴别诊断，治疗药物的选择，药物疗效监控 解脲脲原体 UU-DNA 详见NG-DNA检测取样 适用于UU感染的诊断，淋菌性与非淋性尿道炎，阴道炎的鉴别诊断，治疗药物的选择及其疗效监控,97,梅毒螺旋体TP-DNA 1. 详见NG-DNA检测取样 2.血清：无菌静脉血2ml注入无菌干燥试管中 3.胎盘组织：将分娩或引产时的胎盘组织适量置入无菌管中 适用于梅毒螺旋体感染的早期诊断和先天性梅毒的诊断及其感染病人药物治疗的疗效监控 单纯疱疹病毒型HSV-DNA 1.详见NG-DNA检测取样 2.尿道口或患病部位刮片：用刮片刮取病变处脱落细胞，置入无菌管中 单纯疱疹病毒型引起生殖器疱疹等性传播疾病，用于HSV型感染的诊断及其药物治疗的疗效监控,98,人乳头瘤病毒HPV6.11-DNA 1.详见NG-DNA检测取样 2.宫颈脱落细胞：用刮片取宫颈病变处脱落细胞，置于无菌管中 3.组织活检标本（包括宫颈组织，外阴组织，尖锐湿疣疣状组织等） 6.11等低危型乳头瘤病毒引起尖锐湿疣等良性泌尿生殖系疾病，用于人乳头瘤病毒6.11型感染的诊断及其药物治疗的疗效监控 人乳头瘤病毒HPV16.18-DNA 1.详见NG-DNA检测取样 2.生殖道刮器片：用刮器片取宫颈病变处脱落细胞，置入无菌管中 检测引起宫颈癌的最主要的2种高危型人乳头瘤病毒16，18型，用于宫颈癌重点人群的筛查,99,高危型人乳头瘤病毒HR-HPV-DNA 1.详见NG-DNA检测取样 2.生殖道刮片：用刮片取宫颈病变处脱落细胞，置入无菌管中3.组织活检标本（包括宫颈组织，外阴组织，尖锐湿疣疣状组织等） 检测引起宫颈癌的最主要的8种高危型人乳头瘤病毒（16，18，31，32，45，52，56，58），用于宫颈癌的早期筛查 人乳头瘤病毒基因分型HPV-RDB 1.详见NG-DNA检测取样 2.宫颈脱落细胞：在无菌条件下，用宫颈刷伸入宫颈管内2cm，旋转数周后取出 3.疣体细胞：用无菌棉拭子在疣体部位刮取上皮组织 检测人乳头瘤病毒最常见的19种基因型别，用于宫颈癌早期筛查，型别鉴别及流行病学调查,100,结核分支杆菌TB-DNA 1.痰液：肺深部咳出的痰液1-3ml 2.肺及支气管灌洗液1-3ml 3.尿液：收集中段尿液1-3ml 适用于结核分枝杆菌感染的诊断及其感染病人药物治疗的疗效监控 肺炎支原体MP-DNA 1.痰液：肺深部咳出的痰液1-3ml 2.肺及支气管灌洗液1-3ml 3.咽拭子：用棉拭子取咽部分泌物，将棉拭子置入无菌管中 MP是非典型肺炎的主要致病菌，用于MP感染的诊断，病原体的鉴别诊断及其药物治疗的疗效监控,101,肺炎衣原体CP-DNA 1.痰液：肺深部咳出的痰液1-3ml 2.肺及支气管灌洗液1-3ml 3.咽拭子：用棉拭子取咽部分泌物，将棉拭子置入无菌管中 CP是非典型肺炎的主要致病菌，用于CP感染的诊断，病原体的鉴别诊断及其药物治疗的疗效监控 EB病毒 EB-DNA 1.全血：静脉血2ml注入无菌EDTA或枸橼酸钠抗凝管中混匀 2.咽拭子：取鼻咽拭子 3.组织：取可疑部位组织适量置入无菌管中 适用于鼻咽癌，淋巴癌的辅助诊断，儿科单核细胞增多症等的辅助诊断及其感染病人药物治疗的疗效监控,102,人巨细胞病毒 HCMV-DNA 1.全血：静脉血2ml注入无菌EDTA或枸橼酸钠抗凝管中混匀 2.尿液，乳汁：取晨尿或成熟乳汁10ml于无菌干燥试管中 3.血清：无菌静脉血2ml 适用于孕妇，胎儿，婴幼儿，器官移植受者等人巨细胞病毒感染的诊断和个性化治疗方案制定及疗效监控，为优生优育提供病原学鉴别 弓形虫TOX-DNA 1.全血：静脉血2ml注入无菌EDTA或枸橼酸钠抗凝管中混匀 2.羊水：取羊水10ml于无菌管中 3.绒毛：根据临床情况取适量绒毛于无菌管中 如果孕12周内发生先天性感染，大约40%胎儿可能出现流产，死胎或心脑肝眼等的严重损害，适用于TOX感染的诊断及疗效监控，为优生优育提供病原学鉴别,103,单纯疱疹病毒型HSV-DNA 1.详见NG-DNA检测取样 2.疱疹溃疡部位刮片：用刮片刮取溃疡病变处疱疹液或脱落细胞，置入无菌管中 3.脑脊液：按常规标准方法抽取脑脊液0.5-1ml，置入无菌管中，密闭送检 HSV可以通过母婴传播，使胎儿发育迟缓，先天性畸形或智力障碍，适用于HSV感染的诊断及疗效监控，为优生优育提供病原学鉴别 风疹病毒 RV-RNA 1.血清或血浆：详见HBV-DNA检测取样 2.羊水：取羊水10ml于无菌干燥管中，密闭送检 RV可以通过母婴传播，使胎儿发生先天性畸形，适用于RV感染的诊断及疗效监控，为优生优育提供病原学鉴别,104,地中海贫血 全血：抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检 检测三种最常见的缺失型：东南亚型缺失（-SEA），右侧缺失（-3.7）和左侧缺失（-4.2），用于临床缺失型地中海贫血的辅助诊断 地中海贫血 全血：抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检 检测中国人群常见的14种珠蛋白基因突变，用于地中海贫血的辅助诊断和人群普查，为遗传咨询提供依据,105,21三体和性染色体多倍体 标本为外周静脉血全血，脐血，羊水。外周静脉全血为常规取静脉血2ml，脐血为常规取胎儿脐带血0.5-1ml，EDTA抗凝处理；经穿刺获羊水2-5ml 对临床发病率较高的染色体病如21三体综合征，Klinefelter综合征，超雌综合征进行快速的产前辅助诊断 18三体和13三体综合征遗传病 标本为全血，脐血，羊水。全血为常规取静脉血2ml或胎儿脐血为常规取胎儿脐带血0.5-1ml，EDTA抗凝处理；经穿刺获羊水2-5ml 对临床发病率较高的染色体异常遗传病18-三体综合征和13-三体综合征遗传病进行快速产前筛查的产前临床辅助诊断,106,手足口病-肠道病毒71型 EV71-RNA 1.咽拭子：采集发病3日内的咽拭子，用棉签适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，装入有保存液的采样管送检 2.疱疹液：先用75%酒精对疱疹周围消毒，再用消毒针挑破皮用棉签蘸取疱疹液，装入有保存液的采样管送检 3.血清，粪便，脑脊液等 肠道病毒71型引起的手足口病症状严重，可造成肺水肿，脑炎等严重危害，用于EV71感染的辅助诊断，手足口病感染病毒型别的鉴别诊断,107,手足口病-柯萨奇病毒A组16型CA16-RNA 同EV71取样 用于柯萨奇病毒A组16型感染的辅助诊断，手足口病感染病毒型别的鉴别诊断 手足口病-肠道病毒通用型EV-RNA 同EV71取样 用于各种肠道病毒，柯萨奇病毒，埃可病毒感染引起的手足口病的辅助诊断,108,甲型H1N1流感病毒 H1N1-RNA 鼻咽分泌物等呼吸道样本：用合成纤维拭子采集鼻咽部分泌物，鼻腔吸取物或鼻腔冲洗液，放入含病毒采样液的无菌试管中，立即送检 用于H1N1流感病毒的实验室诊断和流行病学监控 甲型流感病毒IVA-RNA 同H1N1取样 用于甲型流感病毒的实验室诊断和流行病学监控,109,肿瘤融合基因BCR-ABL 外周血 适用于评价患者化疗效果，预后及对微小残留病变复发的检测 肿瘤WT1基因 外周血 适用于缺乏异常染色体核型标记的AML患者的化疗效果，预后及对微小残留病变复发的监测 肿瘤融合基因PML-RARa 外周血或骨髓 用于评价患者的化疗效果，预后及对微小残留病变复发的监测,110,