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16 基因工程（含PCR技术）和细胞工程1.近五年的全国卷高考试题中对于基因工程的考查频度较高，侧重考查基因工程的工具，操作程序与应用等。植物细胞工程的应用以及动物细胞工程技术中的核移植技术、单克隆抗体的制备也有所考查。2.本专题以非选择题的形式考查。题目常借助简洁的文字材料或流程图、结构图等考查有关基因工程、动物细胞工程的原理、技术手段等，尤为注重对教材中一些关键词的填充及对结论性语句的准确表述等。3.考纲新变化：特别提出了PCR技术，考纲6“动物的细胞培养与体细胞克隆”由I变为II，预计2018年高考可能会涉及此考点。在备考时，可以从以下4个方面入手复习： (1)列表比较法掌握限制酶、DNA连接酶和载体的作用。(2)实例分析法理解基因工程的原理和过程。(3)列表比较法理解两个不同，即植物组织培养和动物细胞培养的不同、植物体细胞杂交与动物细胞融合的不同。(4)图解法分析并掌握单克隆抗体制备过程。考点1基因工程1.几种获取目的基因方法的比较2.比较DNA复制和PCR技术3.与DNA有关的酶的归纳与比较4.将目的基因导入受体细胞的方法比较5. DNA的粗提取与鉴定的方法步骤例1.请回答以下有关基因工程的问题：(1)基因工程中切割DNA的工具酶是。DNA连接酶根据其来源不同，分为_和_。(2)利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_。(3)是基因工程的核心步骤。启动子是识别和结合的部位，它能驱动基因转录出mRNA。(4)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是。(5)要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，采用的方法是技术。【解题思路】(1)切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶(限制酶)。DNA连接酶根据来源不同分为Ecoli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。(2)利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成引物。(3)基因工程的核心步骤是构建基因表达载体。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。(4)目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。(5)检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，需要采用DNA分子杂交技术。【答案】(1)限制性核酸内切酶(限制酶)EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶(顺序可颠倒)(2)引物(引物对)(3)基因表达载体的构建RNA聚合酶(4)农杆菌转化法(5)DNA分子杂交有关基因工程概念及其工具的8个错混点 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和运载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。(7)基因工程中的运载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的运载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。考点2细胞工程6.植物组织培养的关键点(1)植物组织培养的关键条件：离体、一定的营养物质、激素(生长素、细胞分裂素)等。培养基状态：固体培养基(脱分化培养基、生根培养基及生芽培养基)。体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。(2)植物激素的使用生长素/细胞分裂素的比值适中时，促进愈伤组织形成；比值高时，促进根分化、抑制芽形成；比值低时，促进芽分化、抑制根形成。(3)光照的使用脱分化阶段不需要给予光照，再分化阶段需要给予光照，以利于叶绿素的形成。7.植物体细胞杂交的关键点(1)酶解法用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。(2)促融剂聚乙二醇。(3)杂种细胞的形成标志新细胞壁的形成。(4)培养为杂种植株的技术植物组织培养。(5)培养成功的原理细胞全能性。8.动物细胞培养的特殊条件(1)胰蛋白酶的使用：首先用胰蛋白酶处理动物的器官或组织，以制备单细胞悬液；培养过程中发生接触抑制时，同样要用胰蛋白酶使细胞分散开。(2)避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理，加入一定量的抗生素，定期更换培养液。(3)特殊的营养条件液体培养基。加入动物血清、血浆等。通入氧气以满足代谢的需要。通入二氧化碳以维持培养液的pH。9.克隆动物的技术手段动物细胞培养、核移植、早期胚胎培养和胚胎移植。10.突破体细胞克隆(1)在细胞核移植技术中，注入去核卵母细胞中的不是供体细胞的细胞核，而是整个细胞，同时伴随有两细胞融合现象，这体现了细胞膜的结构特点具有一定的流动性。(2)该技术中形成的重组细胞最终发育成一个新个体，体现了动物细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。(3)克隆属于无性繁殖，产生的新个体的绝大多数性状与供核亲本相同。(4)利用核移植技术获得的动物与供核动物性状不完全相同：克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞的细胞核，但其细胞质中的DNA主要来自去核的卵母细胞。性状是基因型与环境共同作用的结果，供核动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不完全相同，其性状可能和供核动物也不完全相同。克隆动物在个体发育过程中有可能发生基因突变，产生供核动物没有的性状。例2.单克隆抗体的制备过程如图所示：(1)植物体细胞杂交和单克隆抗体制备，都应用了细胞融合技术，电激和聚乙二醇都可以诱导相应的细胞融合，在诱导动物细胞融合时，还可以用。细胞融合的原理是_。(2)融合后的细胞，仅仅由两个细胞互相融合的类型有_种，其中符合要求的细胞是，其特点为_。(3)向动物体内反复注射某种抗原，并从动物血清中分离出抗体，这种抗体与单克隆抗体相比，存在的缺点是。由单克隆抗体技术研制成的“生物导弹”由两部分构成，其中一部分被称为“瞄准装置”，它作用的原理是，其特点为_。【解题思路】(1)电激和聚乙二醇都可以诱导相应的细胞融合，在诱导动物细胞融合时，还可以用灭活的病毒诱导。细胞融合的原理是细胞膜的流动性。(2)融合后的细胞，仅仅由两个细胞互相融合的类型有3种，其中符合要求的细胞是杂交瘤细胞，其特点为既能无限增殖，又能产生特定的抗体。(3)向动物体内反复注射某种抗原，并从动物血清中分离出抗体，这种抗体与单克隆抗体相比，存在的缺点是产量低、纯度低、特异性差。由单克隆抗体技术研制成的“生物导弹”由两部分构成，其中一部分被称为“瞄准装置”，它作用的原理是抗原与抗体杂交，其特点为特异性强。【答案】(1)灭活的病毒诱导细胞膜的流动性(2)3杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生特定的抗体(3)产量低、纯度低、特异性差抗原与抗体杂交特异性强单克隆抗体制备过程中两次筛选分析第一次筛选：利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞，即AB型细胞(A为B细胞，B为骨髓瘤细胞，不需要A、B、AA、BB型细胞。第二次筛选：利用多孔板法和抗原抗体杂交法筛选，获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。1（2018全国卷I)回答下列问题：（1）博耶（H.Boyer）和科恩（S.Coben）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_（答出两点即可）。（2）体外重组的质粒可通过Ca2+参与的_方法导入大肠杆菌细胞，而体外重组的噬菌体DNA通常需与_组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是_。（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用_的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加_的抑制剂。2（2018全国卷III)2018年细胞期刊报道，中国科学家率先成功地应用体细胞对非人灵长类动物进行克隆，获得两只克隆猴“中中”和“华华”。回答下列问题：（1）“中中”和“华华”的获得涉及核移植过程，核移植是指_。通过核移植方法获得的克隆猴，与核供体相比，克隆猴体细胞的染色体数目_（填“减半”“加倍”或“不变”）（2）哺乳动物的核移植可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，胚胎细胞核移植获得克隆动物的难度_（填“大于”或“小于”）体细胞核移植，其原因是_。（3）在哺乳动物核移植的过程中，若分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常，所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目_（填“相同”或“不相同”），性染色体组合_（填“相同”或“不相同”）。1（2018届江西省五市八校高三下学期第二次联考）Bt基因即苏云金芽孢杆菌(Badcillusthuringiensis，简称Bt)基因，因其表达产物Bt毒蛋白杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。如图为培育转Bt基因苗的基本操作过程。（1）Bt基因可从构建的Bt基因组文库中获取，也可以从其cDNA文库中获取，从前者获取的基因_（填“含有”或“不含有”）启动子。若利用PCR技术扩增Bt基因，此过程中Taq酶所起的作用是。（2）步骤IV中产生的细胞团称为_，步骤IV和V过程要注意控制培养基中的浓度比例，以便获得幼苗。（3）我国西北的一些地区年降雨量很小，只适宜种植少数的草本植物，但却被硬性规定种植转Bt基因的植物，结果造成减产。这个案例主要违背了生态工程的_原理。（4）蛋白质工程也被称为_，其基本途径是从_出发，通过设计预期的蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列，进而找到相对应的_，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物功能进行鉴定。2（2018届河北省衡水中学高三上学期七调）科学家利用细胞融合技术研究细胞膜的结构特性，进行了下列实验。（1）将鼠细胞和人细胞在_培养箱中培养一段时间，用_处理，获取实验用的单细胞悬液。（2）将两种细胞在37下混合培养，在培养液中加入_诱导融合，形成融合细胞，一般两两融合的细胞有_种。（3）细胞膜的主要成分是磷脂和蛋白质。将连接了荧光染料的抗体与融合细胞在一定条件下培养，抗体与融合细胞的膜蛋白（抗原)特异性结合，其目的是标记膜蛋白，以便于显微镜观察。用荧光显微镜观察融合细胞表面荧光的颜色和_，开始时，鼠的细胞为绿色，人的细胞为红色，两种颜色不混合；一段时间后，可观察到红绿荧光交替分布的“嵌合体”。统计_，结果如下图所示。（4）科学家据此提出两种假说解释嵌合体的形成。假说一:融合细胞合成了新的膜蛋白；假说二:原有膜蛋白在细胞膜平面上运动。使用_抑制剂和ATP合成抑制剂分别处理融合细胞，均对嵌合体形成没有显著影响，这个结果否定了假说一。在15、20和26的培养温度下重复上述实验，这些实验的结果为_，为假说二提供了证据支持。1（2019届黑龙江省哈尔滨市第九中学高三上学期期末）请回答下列现代生物科技相关问题：（1）利用基因工程技术，可以获得乳汁中含有药用蛋白的动物，这种动物叫做乳腺生物反应器。为了获得该动物，需将药用蛋白基因与_基因的启动子等调控组件重组在一起，构建基因表达载体，通常采用_技术将该基因表达载体导入哺乳动物的受精卵中，经早期胚胎培养、胚胎移植到_动物体内，最终获得具有所需性状的动物。欲提高胚胎的利用率，可采用胚胎分割技术，胚胎分割是指采用_ 方法将早期胚胎切割成 2 等份、4 等份或 8 等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。（2）若从 DNA 分子中利用 PCR 技术扩增药用蛋白基因，经_次循环后可获得只含有药用蛋白基因核苷酸序列的 DNA 片段。（3）若将药用蛋白基因导入植物细胞，可以用组织培养得到的_（答一项即可）等为材料，经过人工薄膜包装得到人工种子，人工种子在适宜条件能够萌发长成幼苗。（4）若受体细胞为大肠杆菌细胞，则需从导入质粒的受体细胞中筛选出真正导入重组质粒的细胞，该原理为：许多大肠杆菌的质粒上含有lacZ 基因（内含 EcoRI 的酶切位点），其编码的产物半乳糖苷酶在 Xgal 和 IPTG 存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。原理如图所示。请据图回答：菌落中颜色为白色的是_，原因是_。2（2019届黑龙江省哈尔滨市第六中学高三上学期期末）下图表示我国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪的具体培育过程。请据图回答下列问题：（1）图中A过程是采用从_中获取绿色荧光蛋白基因，该文库中含有该生物部分基因序列。如果对已有的绿色荧光蛋白基因进行大量扩增，需要用_方法，该方法的原理是DNA复制，这项技术需要用到Taq酶，该酶需从_的末端开始催化子链的延伸。（2）将绿色荧光蛋白基因导入成纤维细胞，B过程首先要构建_，然后通过_法导入成纤维细胞。（3）从猪胚胎中获取单个的成纤维细胞进行培养，需用C_酶处理猪胚胎的部分组织。（4）E过程得到卵母细胞后，要做去核处理，最常用方法是_。（5）G过程需要用_（化学）方法激活重组细胞，使之完成分裂和发育进程，并最终发育为早期胚胎。（6）过程可以在分子水平上用_方法检测绿色荧光蛋白基因是否成功表达。参考答案1.【解题思路】（1）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。（2）体外重组的质粒可通过Ca2+处理，目的是以增大细胞的通透性，使重组的质粒能够导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2+参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞，噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其它细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。（3）真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解,为防止蛋白质被降解,可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解,在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。【答案】（1）体外重组DNA可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达（2）转化外壳蛋白质（或噬菌体蛋白）细菌（3）蛋白酶缺陷型蛋白酶2.【解题思路】（1）核移植是指将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个胚胎最后发育成为动物个体；通过核移植方法获得的克隆猴的细胞核来自供体，因此克隆猴体細胞的染色体数目和供体一致；（2）胚胎细胞核移植的难度小于体细胞核移植，其原因是动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易；（3）哺乳动物雌性个体和雄性个体的体细胞染色体常染色体相同，性染色体前者是XX，后者是XY，因此分别以雌性个体和雄性个体的体细胞作为核供体，通常所得到的两个克隆动物体细胞的常染色体数目相同，性染色体组合不同。【答案】（1）将动物的一个细胞核，移入一个已去掉细胞核的卵母细胞不变（2）小于胚胎细胞分化程度低，恢复全能性相对容易（3）相同不同1.【解题思路】（1）Bt基因组文库包括苏云金芽孢杆菌的全部基因，是包含启动子的。若利用PCR技术扩增Bt基因，Taq酶能够保证在高温条件下从引物起始进行DNA子链的合成。（2）步骤IV在适宜培养基中诱导外植体脱分化形成愈伤组织，图示中的细胞团称为愈伤组织。步骤IV和V过程分别是脱分化和再分化的过程，需要要注意控制培养基中生长素和细胞分裂素的浓度比例，以便获得幼苗。（3）生态工程的原理包括物质循环再生原理、物种多样性原理、协调与平衡原理、整体性原理、体统学和工程学原理、系统整体性原理。我国西北的一些地区不适合种植转Bt基因的植物，却被硬性规定种植，结果造成减产的案例主要违背了生态工程的协调与平衡原理。（4）由于蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有很多同基因工程技术相似的地方，因此也被称为第二代基因工程。其基本途径是从预期的蛋白质功能出发，通过设计预期的蛋白质结构和推测应有的氨基酸序列，进而找到相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物功能进行鉴定。【答案】（1）含有保证在高温条件下从引物起始进行DNA子链的合成（2）愈伤组织生长素与细胞分裂素（3）协调与平衡（4）第二代基因工程预期的蛋白质功能脱氧核苷酸序列2.【解题思路】（1）动物细胞培养需要一定的气体环境，因此需要放到二氧化碳培养箱中培养；由于胰蛋白酶能水解细胞膜表面的蛋白质，因此常用胰蛋白酶处理动物组织，使组织细胞分散开，进而制成细胞悬液。（2）诱导动物细胞融合常用(灭活的）病毒（或PEG)；合成后的融合细胞一般有3种。（3）细胞膜主要由磷脂和蛋白质组成；抗体与荧光染料结合后抗体被标记，当抗体与融合细胞的膜蛋白（抗原）特异性结合时，膜蛋白就被标记；用荧光显微镜观察融合细胞表面荧光的颜色和分布，并观察和统计嵌合体比例。（4）假如嵌合体形成是融合细胞合成了新的膜蛋白，用蛋白质合成抑制剂和ATP合成抑制剂分别处理融合细胞，嵌合体形成会受影响。分析柱形图可知，随着温度增加，嵌合体比例增加（或“随着温度降低，嵌合体比例降低”）。【答案】（1）CO2胰蛋白酶（2）(灭活的）病毒（或PEG) 3 （3）分布嵌合体比例（4）蛋白质合成随着温度增加，嵌合体比例增加(或随着温度降低，嵌合体比例降低）1.【解题思路】（1）为获得乳汁中含有药用蛋白的动物，可通过基因工程技术实现，可将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，构建基因表达载体，通常采用显微注射技术将该基因表达载体导入哺乳动物的受精卵中，经早期胚胎培养、胚胎移植到同种的、生理状态相同的动物体内，最终获得具有所需性状的动物。欲提高胚胎的利用率，可采用胚胎分割技术，胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成 2 等份、4 等份或 8 等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。（2）每次都是单向复制，只去掉多余基因的一方，把目的基因两方的多余基因都去掉，就要复制两次，从而获得两条纯目的基因的单链，第三轮时这个单链和原链解旋，再产生两条完整的DNA片断双链。（3）若将药用蛋白基因导入植物细胞，可以用组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到人工种子，人工种子在适宜条件能够萌发长成幼苗。（4）用限制酶EcoRI切割质粒时，会破坏质粒上的lacZ基因，但切割后的质粒自身环化后，lacZ基因又被修复，能表达产生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，所以菌落呈现蓝色；菌落导入的是重组质粒，其lacZ基因被破坏，不能表达产生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG存在下，菌落颜色为白色。【答案】（1）乳腺蛋白显微注射同种的、生理状态相同的机械（2）3 （3）胚状体、不定芽、顶芽、腋芽（4）菌落lacZ 标记基因区插入外源基因后被破坏，不能表达出-半乳糖苷酶，故菌落为白色2.【解题思路】（1）根据题意分析，A过程是从含有该生物部分基因序列的文库中获得目的基因的，因此该文库为cDNA文库；扩增目的基因常用PCR技术，需要特殊的耐高温DNA聚合酶（Taq酶）的催化，该酶需从引物的末端开始催化子链的延伸。（2）图中B过程是将绿色荧光蛋白基因导入成纤维细胞的过程，该过程首先要构建构建基因表达载体，然后通过显微注射技术将该基因表达载体导入成纤维细胞（动物细胞）。（3）图中猪胚胎的部分组织需要用胰蛋白酶或者胶原蛋白酶处理，才能获得单个的成纤维细胞。（4）E过程得到卵母细胞常用显微操作去核法去掉其细胞核，以作为核移植的受体细胞。（5）G过程为重组细胞培养成早期胚胎的过程，该过程需要用乙醇、蛋白酶合成抑制剂或者钙离子载体方法激活重组细胞，使之完成分裂和发育进程，并最终发育为早期胚胎。（6）过程绿色荧光蛋白基因表达产生的荧光蛋白可以用抗原-抗体杂交技术进行检测。【答案】（1）cDNA文库 PCR技术引物（2）基因表达载体显微注射（3）胰蛋白酶或者胶原蛋白酶（4）显微操作去核法（5）乙醇、蛋白酶合成抑制剂或者钙离子载体抗原-抗体杂交
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