微生物活菌计数方法.ppt

微生物活菌平板计数方法和技术,微生物肥料和食用菌菌种质检中心曹凤明,微生物计数方法种类,直接计数法核酸计数法活菌计数法（培养法）MPN（Most-Probable-Number）最大可能数法混菌法平板技术法,直接计数法,1.显微镜直接计数比浊法3.电子计数器计数法,1.显微镜直接计数显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液血球计数板：菌体较大的酵母菌或霉菌孢子细菌计数板：一般细菌用途：快速了解发酵液的菌数。常用于生产线上生产过程控制。缺点：不易区分颗粒、死菌体和杂菌，计数与真实菌数有很大差异。不能作为正规计数方法。,2.比浊法根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。根据浊度计算出细菌的数量。该方法一般可以估计出细菌的数量级。经常用于一些特殊的微生物的快速计数，如光合细菌和藻类的测数。但是由于该方法仅能估测菌数，不能准确定量，而且由于一些颗粒和添加剂的作用，不能正确反映该样品的质量，所以在质检过程中不予采用。,3.电子计数器计数法工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。不适于微生物肥料产品的检测。,核酸计数法,每一种生物都有一套自己独有的遗传物质，脱氧核糖核酸和核糖核酸，即DNA和RNA。随着核酸分析技术的发展，已经能够利用遗传物质对生物进行定性和定量的测定，而且更为灵敏、迅速、专一性强。常用的方法：荧光定量PCR此法操作精细繁琐，药品昂贵，而且经常受到死菌体的干扰。暂时不能成为微生物肥料活菌计数的常用方法，,活菌计数法（培养法）,MPN（Most-Probable-Number）最大可能数法（主要用于光合细菌和（粪）大肠菌群的测定）混菌法（适用于兼性厌氧微生物的测定）取1.0mL不同稀释度菌悬液于灭菌平皿内，将冷却至50左右的1520mL培养基倒入培养皿内轻轻混匀，培养计数。（食品中乳酸菌总菌数的测定）平板计数法（最常用的方法）,平板计数法,使不可见的微生物在人工培养基平板上生长成为可见的菌落（CFU），从而可用肉眼进行观察、计数。较其他方法直观准确，是一种经典的检测活菌数的方法，也是目前国际上通用的方法。制备一定体积的菌悬液，作一系列的倍数稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，计算出样品中的活菌数。,平板计数法示意图,平板计数的优缺点优点：直观、准确、可靠该方法不仅可以检测到样品中的有效活菌数，而且可以检测到产品的微生物污染情况，即杂菌数。缺点：由于培养基和培养条件的局限性，所得的结果一般低于实际值。,平板计数法,（一）检测前的准备（二）操作过程（母液制备、系列稀释、加样、涂布、培养、菌落识别、计数）（三）计算,（一）检测前的准备,根据菌种的特性选择方法天平，摇床，酒精灯，培养箱，染色液，显微镜，灭菌锅，烘箱等无菌间或洁净工作台消毒吸管、刮刀、培养皿的洗涤、包扎、灭菌制样和稀释用三角瓶水制备、灭菌培养基制备和平板制备,培养基制备培养基定义指人工方法配合而成的，专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保存用的混合营养物制品。培养基的选择需要了解目的微生物的基本特性，选择正确的培养基培养基的制备程序按微生物肥料实验用培养基技术条件规定执行，NY/T1114-2006培养基标识清晰，培养基名称，配制日期等。,检测前的准备,平板制备,灭好菌的培养基冷却至50左右（以不烫手为宜），在无菌状态下倾注培养基。倾倒平板前应将培养基摇匀，防止在瓶底有沉淀。但是摇动时要防止产生大量气泡。通常条件下平板制备好后室温放置或温箱放置23天使用，目的：一可以检查培养基是否灭菌彻底，是否在倾倒过程被微生物污染；二为了使平板表面干湿适宜，防止菌落由于平板上的水滴运动而连片以致无法计数。,检测前的准备,（二）操作过程,2.1母液制备2.2系列稀释、加样和涂布2.3培养2.4识别和计数,2.1母液（基础液）的制备,样品混合均匀：很重要固体样品：称取10g左右样品加入到100mL无菌水（500mL三角瓶）中，静置20min。液体样品：量取10.0ml样品加入到90mL无菌水（500mL三角瓶）中，静置20min。分散菌体：将三角瓶置于摇床上200r/min振荡30min，即成母液菌悬液。,2.2样品稀释、加样和涂布,准备工作：应将平板上做好标记，包括培养基种类，样品编号，稀释度/稀释倍数.将小瓶无菌水写好样品编号、稀释度/稀释倍数具体过程见GB20287-2006农用微生物菌剂,2.2.1系列稀释用无菌吸管分别吸取5.0mL上述母液菌悬液加至45mL无菌水（150mL三角瓶）中，按1:10(10倍)进行依次稀释，分别得到10-1，10-2，10-3，10-4等浓度的菌悬液（每个稀释度应更换无菌吸管）注：稀释度：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5相当于稀释倍数：101，102，103，104，105,2.2.2加样和涂布,每个样品取3个连续适宜稀释度，用0.5mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至预先制好的固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度的菌悬液均匀地涂于平板表面。每一稀释度每种培养基做3个重复，同时以无菌水作空白对照。,稀释、加样和涂布注意事项,整个程序应在无菌间或超净台内进行，操作人员时刻有无菌概念适宜稀释度：根据标准或企业提供的信息选择稀释度。系列稀释时不同的稀释度应更换吸管（移液管），加样和涂布不同稀释度时也要更换吸管和刮刀。每个培养皿均要标明培养基种类、样品编号、稀释度稀释和加样要准确，涂布均匀及时，使用的吸管量程要适宜。无菌水对照，以检查吸管、刮刀以及稀释用水灭菌是否彻底、操作过程是否合乎无菌要求。,2.3平板的培养,将涂布好平板放在适宜的条件下培养如：温度条件气体条件培养时间平板倒置培养,2.4菌落识别和计数,通过菌落识别、涂片染色、镜检观察，确定有效菌。（必要时做生化实验）选择性培养基上长出的菌落并非都是有效菌，培养基的选择性是相对的。一种有效菌只在一种特定培养基上计数，不同培养基上同一种有效菌不能累加。细菌杂菌（包括放线菌）在培养细菌的培养基上计数；霉菌和真菌杂菌在真菌培养基上计数。但也不能重复计数。,（三）计算,3.1有效稀释度的选择3.2标准差3.3计算公式及示例,3.1有效稀释度的选择,参见标准GB20287-2006的6.3.2.4示例：（表格）,计数原则以出现20300个细菌菌落数的稀释度的平板为计数标准，丝状真菌为10150个菌落数。当只有一个稀释度，其平均菌落数在20300之间时，则以平均菌落数计算。若有两个稀释度，其平均菌落数均在20300之间时，应按两者菌落总数之比值决定：若其比值小于等于2应计算两者的平均数；若大于2则以稀释倍数小的菌落平均数计算。,3.2标准差,标准差(StandardDeviation)：各数据偏离平均数的距离（离均差）的平均数，它是离差平方和平均后的方根。用表示。标准差体现随机变量取值与其期望值的偏差。标准NY411-2000固氮菌肥料的7.2.6.2。,平板上菌落数对应的标准差要求,标准差分析（例子）,3.3有效活菌数和杂菌的计算,示例,样品编号：A样品状态：颗粒执行标准：GB20287-2006菌种名称：巨大芽孢杆菌称样量：10.10g,有效活菌数测定原始记录表,杂菌测定原始记录表,结果判定（示例）,标准要求产品测定结果有效菌数：2.0亿/g1.20亿/g霉菌数：3.0106个/g0.69106个/g杂菌率：30.0%14.28%结论：该样品的有效菌数不合格；霉菌数和杂菌率合格。,回顾关键点,培养前的准备样品制备、稀释、涂布、培养有效菌和杂菌的确认计算,谢谢,