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NIPT综述,部门：临床医学部姓名：曹光鑫日期：2017.12,NIPT以后能查什么！,目录染色体非整倍体亚染色体异常单基因遗传病胎儿全基因组的构建,染色体非整倍体（一）NIPT行业进展,欧美等国在NIPT纳入国家级医保系统方面的进展2015年7月，瑞士首次将NIPT纳入国家级健康保险系统。英、美、德、日、法、荷兰、新西兰、比利时等许多国家均已开始进行NIPT普及的评估。2016年开始，我国多个地区陆续表示，建议将NIPT纳入医保。,染色体非整倍体（二）NIPT纳入医保势在必行,纳入医保的前提条件：NIPT纳入医保是医疗保障政策的大势所趋，是行业发展的必然结果！,驱动力,政策保障,质量保障,形成大规模的社会需求,“近似于诊断的高精准度筛查技术”,在临床应用中已有对应的政策规范,仪器,试剂耗材,检测服务,分析软件,染色体非整倍体（三）NIPT市场布局,合并恶性肿瘤的孕妇,应用限定,产前筛查高风险，预产期年龄35岁的高龄孕妇,保证cffDNA浓度,技术限制,孕周12周的孕妇,高体重(体重100千克)孕妇,双胎妊娠的孕妇,染色体异常胎儿分娩史，夫妇一方有明确染色体异常的孕妇,孕妇1年内接受过异体输血、移植手术、细胞治疗或接受过免疫治疗等对高通量测序产前筛查与诊断结果将造成干扰的,通过体外受精-胚胎移植方式受孕的孕妇,胎儿影像学检查怀疑胎儿有微缺失微重复综合征或其他染色体异常可能的,各种基因病的高风险人群,各种嵌合现象,染色体非整倍体（四）NIPT技术规范限制条件解读,染色体非整倍体（五）胎儿游离DNA浓度8种检测方法,亚染色体异常（一）检测的必要性,常染色体重复或缺失的片段较大的话对于胚胎是致死性的，如果片段较小（一般20Mb以内），胎儿存活，大部分表现为多发畸形、发育迟缓、智力低下等综合征。绝大多数微缺失综合征（5Mb以内）在宫内发育期间基本无异常表现。微缺失微重复疾病目前已发现近300种，合并发病率近1/600。其遗传特点常为显性发病，以新发突变为主(约占85%95%)，家族性遗传约占5%10%。最佳防控阶段：二级预防,亚染色体异常（二）常见检测技术及优缺点,亚染色体异常（三）亚染色体异常的产前筛查与诊断方式,针对特定目标的检测方式：FISH、BoBs全染色体组筛查方式：CMA+FISH；NIPT-plus+FISHNIPT-plus+FISH优缺点：非侵入分辨率高数据处理难度大,应用进展ISPD在2015年8月更新了NIPT的临床指导意见。明确指出NIPT可以针对研究清楚的染色体微缺失/微重复综合征进行检测。2017年初，吉林省出台了NIPT-plus的地方标准。改进措施提高cffDNA浓度增加测序深度改进生物信息学分析方法,亚染色体异常（四）NIPT-plus的应用进展及改进措施,五大类遗传病中，病种最多的当属单基因病。截止到17年初，OMIM正式收录的超过8000多种。遗传机制明确的有5000余种，一部分发病率高，危害性大的常见单基因病已能进行临床基因诊断。例如：遗传性耳聋、杜氏进行性肌营养不良（DMD）、和地中海贫血、先天性肾上腺皮质增生症（CAH）、枫糖尿病（MSUD）、血友病、镰状细胞病、威尔逊病.,单基因遗传病（一）发病情况,单基因遗传病（二）分析方法,致病机理明确的单基因遗传病实现临床应用的基础：科学基础：遗传基础明确、包括致病基因、遗传模式.技术基础：成熟的检测技术、可靠的分析方法.临床基础：技术定位、适用范围、风险、标准.致病机理不明的单基因遗传病家系分析：Trios模式检测方式：半定性检测、RMD、RHDO、GRAD,一次人全基因组测序给出的原始变异位点可达400万个；一人全外显子组测序给出的原始变异位点可达2-5万个。对于WES来说，第一步、通过测序质量、变异位置、类型、MAF等指标的过滤，可选择的变异数可降至数千。第二步、与已知变异数据库或实验室内部建立的变异数据库比较，可将候选变异数再降低至数百。第三步、如果对一个家系中多个患者或携带者进行测序，还可通过综合分析，进一步降低候选变异数，从而使真正的变异“水落石出”。,单基因遗传病（三）致病突变位点的筛选,单基因遗传病（四）遗传家系分析,单基因遗传病（五）检测方式,半定性分析：父源性变异性连锁：Y/X突变基因连锁SNP：相对突变剂量分析（RMD）相对单体型剂量分析(RHDO)全基因组相对等位基因剂量分析（GRAD）,单基因遗传病（六）RMD和RHDO,RMD,RHDO,GRAD分析方法是RMD与全基因组测序技术结合的方法。GRAD策略可以通过高深度测序获得的高质量基因组信息直接检测母体血浆中杂合等位基因的序列信息，进而通过SPRT方法检测出母体中杂合等位基因的相对含量，在原理上与RMD策略相同。与全基因组测序RHDO不同的是GRAD无需构建母亲的单倍体型，并且高深度全基因组测序将检测的分辨率提升了约90倍。,单基因遗传病（七）GRAD,全基因组构建（一）有核红细胞,有核红细胞优势：单核，拥有完整的胎儿基因组。孕早期胎儿血中含量丰富且孕妇外周血中罕见。形态上易于辨认表面有多种特异性的抗原，作为细胞标记而利于细胞的分类、鉴定和聚集。其在孕妇外周血中的生存期短（90天），不会持续到下一次妊娠。,全基因组构建（二）FNRBC富集分选及鉴定,NRBC富集分选方法密度梯度离心：25倍显微镜操作抗原/抗体：流式、磁珠亲和素：SBA电荷流分离法：产量高、纯度低定向诱导培养法端粒长度FNRBC鉴定方法：多个X-STR位点联合AMXY基因扩增显微镜观察：染色、形态,全基因组构建（三）单细胞全基因组的构建,单细胞基因组扩增模板依赖性多重置换扩增技术（tdMDA）多次退火循环扩增技术（MALBAC）乳液全基因组扩增技术（eWGA）转座子插入线性扩增（LIANTI）扩增产物分析NGSCMA,全基因组构建（四）研究进展,2016年7月，解放军总医院戴朴教授申报的常见单基因病及基因组病无创产前筛查及诊断技术平台研发及规范化应用体系建立获批“十三五”首批国家重点研发计划重点专项。此项目致力于母血胎儿游离核酸分离富集及分析技术，开发NIPT新算法以及胎儿有核红细胞识别捕获，研发基于有核红细胞的NIPT新技术和平台，突破传统无创产前检测的瓶颈。目前已经有通过FNRBC检测单基因病如DMD、CAH、地贫、先天性耳聋的报道。,检测技术的革新,三代测序（3GS）优点：测序读长较长避免了PCR扩增带来的出错拓展了测序技术的应用领域缺点：总体上单读长的错误率依然偏高依赖DNA聚合酶的活性,END,
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