肌酐检测标准化徐国超.ppt

肌酐标准化及清除率探讨,新乡市中心医院检验科徐国超,肾脏疾病的现状,慢性肾脏病（CKD）在全球范围的发病率和患病率呈迅速增长的趋势,其主要与人们生活水平和生活方式改变相关的糖尿病、高血压发病率上升有关。2002年美国肾脏病年报，在美国早期CKD患者有1900万，其中估算肾小球滤过率eGFR60ml/min，尿微量白蛋白排泄率正常（30mg/gCr）有1100万。美国1988到2006年的调查同样显示，替代治疗和终末肾的发生率逐年增加。,我国目前尚无大规模、权威性的调查报道，北京大学第一医院王海燕教授牵头进行的流行病学调查研究报告显示，慢性肾病的发病率占普通人群的9.4%，据此推算我国慢性肾病的患者已经超过一亿人。,在临床实践中慢性肾病的早期诊断、早期检测和早期治疗就显得非常重要诊断、治疗以及监测慢性肾病的前提为正确判断肾功能。美国肾脏基金协会（NKF）将慢性肾病定义为：除外其他原因，肾脏的结构或肾功能受到损害或者肾小球滤过率下降到低于来对慢性肾病的严重程度进行分级。因此，肾小球滤过率是目前监测肾功能的最好指标。,GFR测定的金标准为菊粉、碘海群（iohexol）或核素标记的DTPA清除率。这些方法复杂，操作难度大，一般仅限于研究作为建立eGFR估算方程比较对象。血清CystatinC是近几年被评价较多的反映GFR的指标，大量临床实践表明，血清CystatinC诊断GFR下降较血清肌酐的特异性和敏感度要高，与CCr相比较也稍有优势。其测定采用的是颗粒增强免疫比浊法，测定成本目前还较高。因为测定价格、适用于生化分析仪的高通量检测方法刚刚问世不久以及主要基于CystatinC估算的GFR方程发表不长时间尚需进一步验证等诸多因素，因此尚未见到有关以CystatinC为诊断指标的CKD患病率的流行病学研究的资料。,血清肌酐（SCr）水平受到年龄性别、种族、肌肉量、饮食的影响，苦味酸动力学法测定方法还受黄疸、乳糜、溶血和某些药物的干扰。但由于肌酐血清水平相对恒定，不被肾小管重吸收，排泌量较少，测定廉价，是临床上应用最为广泛的评价GFR的试验。肌酐清除率（Ccr）较Scr更灵敏/特异的反映GFR下降的指标，但必须准确留取4小时、8小时或24小时尿液，病人，特别是门诊患者依从性差，也不适合于流行病调查。,对于血清肌酐测定，大家已有共识：只有当GFR下降50%时才开始升高。我们以99mTc-DTPA清除率测得的肾小球滤过率（GFR）作为诊断评价的金指标，用受试者工作特征曲线（ROC）观察到肌酐最佳诊断界值为107mol/L，与参考区间上限的99%分位值（男性110mol/L，女性93mol/L）接近，其诊断肾小球滤过功能受损的的灵敏度、特异性分别为74.6%、90%。如果诊断界值移到133mol/L，灵敏度会提高，但灵敏度则下降到50%。建议以99%双侧作为血清肌酐的参考区间，但必须清楚诊断界点的诊断效能。,肌酸激酶（运动）肌酸+ATP磷酸肌酸+ADP脱水自动去P肌酐90%以上由肾小球滤过而从尿中排出，仅710%由肾小管分泌排出，但肾小管对肌酐不重吸收。,肌酐的代谢:1代谢：肌酐是由肌肉酸脱水而生成，肌酸在肾、肝、由精氨酸、甘氨酸合成，贮于肌肉、脑中，在肌肉收缩时，可进一步代谢生成肌酐。,肌酐(Cr)和内生肌酐清除率（CCr）测定,正常人每天更新是恒定的，约更新2%，由肾排出，人体血液中肌酐的生成可有内、外源性两种如在严格控制饮食条件和肌肉活动相对稳定的情况下，血浆肌酐的生成量和尿的排出量较为恒定。肌酐的测定在控制外源性来源、未进行剧烈运动的条件下，肌酐的血中浓度主要取决于GFR，在肾功能受损，GFR下降到临界水平时血中肌酐浓度明显上升，随损害程度加重上升速度也加快。反映GRF减退的后期指标。当肾小球滤过功能减退至50%时，cr仍可正常。cr在临床应用中应注意动态观察和结合其他实验室指标来分析。,注意事项：1.日内生理变动幅度通常在10%以内，但与个体肌肉量有关。肌肉发达者与消瘦者（尤其是肌肉萎缩者）肌酐的生理浓度可有明显差异。2.妊娠期内因生理原因GFR可上升，但肌酐生成速度不变，Scr因血浆稀释作用而比常人偏低，据调查多在35.252.8mol/L水平。如孕妇Scr70.4mol/L应视为有升高倾向。3.剧烈肌肉活动后血肌酐和尿肌酐都有一过性增加。4.进肉食对Scr和Ucr有一定影响。根据对健康人观察，摄取烹饪肉食后2-4小时内Scr可增加34-44mol/L，可超出正常值上限，约12小时后接近正常水平。5.Jaff（雅费氏）法主要缺点是特异性差，血中丙酮、丙酮酸、叶酸、抗坏血酸、葡萄糖、乙酰乙酸等都能在此反应中呈色，因而被称为“非肌酐色原”。此外，一些头孢类药物如甲氧噻吩头孢菌素也可与苦味酸反应显色而引起正干扰。,根据Jaff（雅费氏）反应原理发展而来的动力学方法，基于肌酐和上述非肌酐色原在反应速度上的差异，即后者与苦味酸发生反应比前者要慢，利用这一点来避开非特异反应的干扰（但不能根本消除）。此法干扰和影响因素较少，速度快，适用于自动分析，近年已被普遍采用。,肌酐测定。1)Jaffe反应法：测定肌酐最常用的方法是尿、血清中的肌酐与苦味酸盐作用，生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高，维生素C、丙酮酸、丙酮、葡萄糖、乙酰醋酸、果糖、氨基马尿酸、蛋白质、胍基醋酸酰胺及许多化合物也能与碱性苦味酸盐生成红色。这些能起反应的物质称为假肌酐，相当数量的假肌酐存在于红细胞中。,为去除假肌酐的影响，现在常用速率法来测定血肌酐。乙酰乙酸在20s内已与碱性苦味酸反应完成，其他多数干扰物则在80s后才与苦味酸有较快的反应，而20-80s之间主要是肌酐的反应。因此，血清与苦味酸混合后，分别读取510nm在20s及80s时的吸光度检验肌酐浓度.,2）酶联法：,此法特异性高，标本不需去蛋白，特别适用于自动分析。但工具酶过多、价格昂贵。,三）内生肌酐清除率（CCr）,1.定义：肾脏在单位时间内将若干ml血液中的内生肌酐全部清除出去。2.方法：收集24小时尿并计尿量，试验前应给受试者无肌酐饮食（禁肉类、鱼类）3天，并限蛋白入量（每日低于40g），避免剧烈运动，以排除外源性肌酐的干扰。留取24小时尿，其间保持适当的水分入量，禁服咖啡、茶等利尿性物质。准确计量全部尿量V（ml）。同时抽病人血约2-3ml。,3.计算：,体表面积的计算：logA(m2)0.425log体重kg0.725log身高cm2.144,参考值：根据体表面积校正后，范围为80-120ml/min/1.73m2。,1999年美国肾脏病基金会（NKF）公布的K-DOQI（KidneyDiseaseOutcomeQualityInitiative）指南提出了新的CKD定义，确定CKD的诊断应基于肾小球滤过率（GFR）和/或肾损伤的证据。CKD的诊断标准为：（1）肾脏损伤（肾脏结构或功能异现常）3个月，可以有或无GFR下降，可表现为以下任何一条病理学检查异常；肾损伤的指标：包括血、尿成分异常或影像学检查异常；（2）GFR60ml/min/1.73m23个月，有或无肾脏损伤证据。根据肾小球滤过率，K-DOQI指南将CKD分为五期I期，GFR90，伴有其他慢性肾损伤证据；II期，GFR6089伴有其他慢性肾损伤证据；III期，GFR3059；IV期，中度异常；GFR1529；V期，已确定有肾功能衰竭；GFR15或正在接受透析。不同分期CKD患者的症状及各种合并症的发生率不同分期对于临床处治具有一定指导价值,1999年，LeveyAS等利用了1628例CKD病人的资料，以碘酞酸盐清除率作为金标准，考虑了病人年龄、性别、血清肌酐（Scr）、尿素、白蛋白等因素，进行数学运算和方程模拟，开发了一系列GFR的评估方程，用来估算GFR，其中方程7因其结果相对准确而被广泛采用。2000年，作者又将方程7进行简化，得出主要基于血清肌酐的简化的“四变量”（年龄，性别，种族以及血清肌酐）MDRD计算方程，该计算方程仅需测量Scr，结合病人的年龄性别，即可推断出GFR。该方程中肌酐的单位为mg/dl。,研究表明，MDRD方程的开发对象是CKD患者，适用于评估西方CKD人群GFR，其准确性和方便性均优于肌酐清除率（Ccr）对于糖尿病和非糖尿病患者的应用诊断效能类似。MDRD的应用应该注意：对于健康人或GFR90mLmin-1的CKD患者此研究公式的性能不明。此研究公式应用于儿童，75岁以上的老年人，孕妇，有严重并发症的患者或体型极端，肌肉量大或营养不良的人可能会产生估算GFR的误差。不推荐应用于健康个体或所有住院患者肾功能的评价。估算儿童GFR多采用Schwartz（施瓦兹）和Filler方程，因为考虑了GFR和身高/血肌酐之间的比例关系。Schwart公式：GFR=k身高(cm)/血肌酐(mol/L)，k为常数（0-18个月正常婴儿k为40，2-16岁女孩及2-13岁男孩k均为49，13-16岁男孩k为62）。,Filler公式,国际上有很多对MDRD方程的评价、改良和验证（谌贻璞.正确应用肾小球滤过功能检验十分重要.中华检验医学杂志，200730（4）：374-276），国内也作了相关的研究，对于各个方程在各期慢性肾脏病中应用研究正在进行当中。我们的研究结果发现，以简化的MDRD方程作为模型计算CKD患者eGFR，当其小于29ml/min时，SCr,CCr和CystatinC三者异常率为100%，在39-59ml/min之间时，三者为84%、91%和98%，在60-89ml/min之间时，三者则为6.8%、70%和86%。在这项普通的研究中，虽然没有进行GFR金指标的检测，但结果提示：与其他两项具较好诊断特异性和敏感度的常规指标CCr、CystatinC比较，eGFR60ml/min时符合率很高，进一步说明60ml/min作为CKD的诊断阈值具有较好的特异性；eGFR在39-59ml/min之间患者的SCr阳性率为84%，SCr可能有16%的假阴性，说明SCr不应该单独应用。eGFR在60-89ml/min，甚至大于在大于90ml/min的CKD患者组中，仍有相当高比例的CCr和CystatinC异常。进一步说明，综合分析病人病史、治疗史和危险因素，联合检测SCr，eGFR，CCr和CystatinC，对于高危患者进行动态监测，将有助CKD的早期诊断,血清肌酐测定方法间的偏差及其对eGFR值的影响,影响eGFR估算值估计不确定度（estimateduncertainty）的来源有：肾脏滤过功能本身的生物学变异。肾脏滤过功能受到运动、体位、血压变化、妊娠、血糖控制、细胞外液、急性或慢性肾脏病等的影响。血肌酐的生物学变异。肾脏滤过功能本身的生物学变异等因素影响血循环或尿中各个标志物的浓度水平，包括估算方程中各个参数的浓度。有研究报告，非CKD患者血清肌酐的生物变异可以达到4.1%-4.3%。建立模型所用“金标准的重复性和方程中各参数测定方法的准确性、重复性及其抗干扰能力（特别是肌酐测定方法的不确定度和抗干扰能力）。,回归误差考虑到各种误差的类型，指南建议eGFR偏离小于30%仍然是可以接受的。在简化MDRD方程中的诸测定参数，肌酐测定的不确定度对eGFR的影响最大。2003年美国病理学院（CAP）观察了80mol/L没有基质效应的新鲜人血清在50个不同方法组间的测定变异，结果测定的SD为5mol/L，以气相色谱-质谱法作为参考方法，观察常规测定结果与真值之间的差异，结果测定偏倚为-5.3-27mol/L。如果一年龄为60的女性患者血清肌酐值为88mol/L，以简化方程计算得到eGFR为60ml/L，如果测定的方差为5.3mol/L,eGFR变化的95%可信区间为53-69ml/min，eGFR测定偏差达13%；如果测定的方差为10mol/L,eGFR变化的95%可信区间为46-84ml/min，eGFR测定偏差达30%。在美国CKD教育计划实验室协作组提出肌酐测定的质量要求ImprovetheprecisionofcreatininemethodstomeetthetotalerrorgoalforserumcreatininemeasurementdescribedinthepaperpublishedinClinicalChemistry2006；52（1）：5-18，血清肌酐测定的不精密度0.08mg/dL（7.1mol/L），与参考方法IDMS的偏差0.05mg/dL（4.4mol/L）。同时建议报告血清肌酐结果采用SI制时保留1位小数点位置，以传统单位mg/dl报告结果时应保留2位小数点,人血清肌酐测定标准化研究进展,1、人血清肌酐测定的常规方法及不同测定系统间的变异人血清肌酐常规测定方法有两类：Jaff碱性苦味酸动力学法和酶法。碱性苦味酸法测定除有上述局限性外，还有同样都是Jaff法，开放的自建系统与Beckman为代表的封闭系统间，在低于病理值时呈正偏差，高于病理值时呈负偏差，要把这两类方测定的结果统一是非常有难度的,2007年徐静等在中华检验医学杂志发表了北京13家31个血清肌酐测定系统的现场比对实验发现，测定均值为82mol/L和92mol/L的冰冻血清样本苦味酸测定的变异11%和10%，酶法测定变异为10.3%和8.5%，测定变异较CAP调查CV%明显偏大，不能满足临床的需要。不同系统间的差异与先前童清等发表的北京市48家三级医院临床化学现场调查结果类似。这种从测定系统的统计上看，被调查的所有自建系统（A试剂配B家校准品，在C家仪器上测定）均没有采用配套的校准品，进一步的调查发现，所有自建系统，与Beckman原系统比较，在肌酐小于和大于200mol/L，有明显的正（高至12%）和负偏差（低至-9%）。测定均值为82mol/L的样本在自建测定系统间的变异接近10%，而封密的Beckman系统测定小于4%。由于自建立分析系统（英文称之为nonhomogeneoussystem）未经科学比对，是实验室间测定差异大的重要原因。而酶法测定变异明显比苦味酸方法低，但酶法较苦味酸法测定结果系统偏低3.5-8.8%。,实验室间血清肌酐测定值的一致性和准确性（不确定度）不能达到临床的要求，使得估算eGFR的不确定度较大，可比性不理想，影响了eGFR的推广应用。血清肌酐测定标准化是一个世界难题，我们国家临床诊断检测系统测定量值或校准的定值的溯源性研究刚刚起步，血清肌酐测定多为自建、未经严格比对的检测系统，因此肌酐测定的标准化工作格外困难，。由于血清肌酐苦味酸测定的变异大，特别受血清内源性物质如胆红素、维生素C、蛋白质含量、溶血、药物等的影响，当重复性好，可以溯源到质谱的肌酐酶法测定方法问世后，肌酐碱性苦味酸动力学法测定的时代应该结束了。当然在使用MDRD-EPI时，要求血清肌酐测定方法应采用酶法，肌酐酶法测定结果应该溯源到质谱法。,2007年后美国CDC发布血清肌酐测定标准物质CRM567，后面还要介绍，该物质具有互换性可以用于常规方法的准确度考证。美国病理学家协会同样也推出用于血清肌酐准确度验证的标准物质LN-24。在此推动下，很多厂家在血清肌酐测定量值溯源方面作了大量工作，包括积水、罗氏酶法、强生新一代肌酐干化学酶法、贝克曼新一代苦味酸法、西门子苦味酸法和测定结果均具有良好的准确性，这些方法测定量值可以溯源到肌酐测定的最高标准ID-MS方法，他们的测定性能可以满足临床要求。,无论是溯源到ID-MS的酶法还是苦味酸法，其测定结果较传统的碱性苦味酸法测定系统偏低，因此肌酐酶法测定的参考值和苦味酸法应该不同，迄今也尚未见到采用溯源到质谱测定肌酐的参考值的权威报告。椐北京大学第一医院王学晶和李海霞大夫未发表的资料表明，采用溯源到ID-MS的方法测定到男性血清肌酐测定结果显著高于女性，小于60岁组显著高于大于60岁年龄组。血清肌酐小于60岁组和大于60岁年龄组男性和女性血清肌酐95%、97.5%和99%分位结果分别为：87mol/L，93mol/L、102mol/L和65mol/L，60mol/L，71mol/L以及105mol/L、109mol/L、111mol/L和77mol/L、83mol/L、91mol/L,肌酐标准物质的研究现状,NIST标准物质（SRM）914a为肌酐的纯度标准物质（结晶），用于参考方法的校准。SRM914a的定标液是用肌酐纯品溶于缓冲液制备的，由于与血清基质不同，这种校准品用于常规方法的校准NIST标准物SRM909-b-1、b-2和参考物质参考方法研究院IRMM）提供有证参考物质（BCR573，574，575）为多水平的冻干人血清基质标准物质，其中肌酐的定值方法为气相色谱分离同位素稀释质谱法（GC-IDMS）这些标准物质可以用于较高一级参考测量程序的真值质控品。虽然这种物质为人血清基质，但经过冻干等加工过程，其与病人新鲜患者血清间的互通性尚未证实，所以如果以上参考物质校准常规方法时，测定结果可能会出现偏差。,尽管实验室自动化技术有了长足进步，肌酐标准化的需求也愈加迫切，在过去的十几年里，以Jaffe法为基础的检测方法的室间变异并未减小，这是不得不正视的现实；同时，该研究也指明了，标准化问题并不能改变分析干扰问题（非特异偏差），此外厂商也应通过与参考系统更好的校准来减小其方法的偏差。,人血清肌酐测定的参考方法被比利时Ghent大学、德国临床化学和检验医学学会（DGKC）和NIST提名的三种GC-IDMS方法被国际检验医学溯源联合委员会（JCTLM）认可为血清肌酐的参考方法。这三种方法均需要除去肌酸的预处理步骤，因为肌酸会产生与肌酐相同的衍生物干扰测定。前衍生和样本的预处理过程步骤复杂、费时。液相-同位素稀释质谱法（-）正被提名为血清肌酐测定的参考方法LC-IDMS较GC-IDMS对于样本的处理简单和快速。我国计量院和卫生部临床检验中心也建立起了ID-MS参考方法。北京大学第一医院参加了JCTLM委托DGKC举办2006年度肌酐国际比对，采用的方法为HPLC-UV检测法。当时该计划只有两家实验室参加。另外一家参考实验室采用的是ID-MS检测。北京大学一附院的结果较ID-MS检测法系统高10%，并且方法的不确定度也高达10%。从临床应用的角度，这种偏差是不可以接受的。偏差的可能原因是内标物的选择或校准不当，也可能是方法学本身性质所决定。方法学的变异偏大，可能原因是样本的处理和/或内标物的选择不合适。,2009年起北京大学第一医院建立起一种HPLC离子交换UV检测的方法检测血清肌酐，该方法与推荐的质谱法有一个不到6mol/L明确的正偏差，但重复性好。该方法简单快速，应该可以作为ID-MS第三方验证的方法。不同系统间人血清肌酐测定值偏差较大，并且影响到eGFR的应指标，包括肌酐的参考值是否需要改变，肌酐清除率结果诊断界用，这应该受到临床实验室和临床医生的关注。对于临床实验室肌酐参考值是否更改，每个国家自己建立的eGFR方程是否需要修正都有应该对本实验室各个肌酐测定系统测定结果按照行业通行标准仔仔细评估影响。不管在中国，还是在国际上血清肌酐测定的标准化需要计细进行方法学比对，以决定本实验室测定系统的选择，应该选择溯源到ID-MS的酶法作为本实验室的方法。临床医生的参与。,酶法真的完美吗？,临床投诉-肌酐的异常波动肌酐，给我们带来的尴尬和思考检测系统基本性能问题带来的结果误差？-质控在控什么干扰带来的肌酐假性降低?为什么只用酶法肌酐检测的结果偏低?-方法学有问题？,文献检索，初步线索医嘱回顾，发现端倪初步试验，进行确认,多贝斯胶囊（羟苯磺酸钙）是-种口服血管保护剂，对DR的三高因素有明显的抑制和逆转作用。它可降低毛细血管高通透性，降低血液高粘滞性，降低血小板高活性，从而减轻视网膜渗出、出血，减少微血管瘤等。,主要治疗1、糖尿病引起的视网膜病变：2、微循环障碍引起的心、脑、肾疾病，如肾小球动脉硬化症等；3、降低血液粘稠度；4、防止微血栓形成；5、四肢麻木、疼痛，皮肤瘙痒；6、静脉曲张等综合症。,初步调查结论-羟苯磺酸钙干扰酶法肌酐的检测，造成结果明显假性降低。后果：错误评估糖尿病肾病患者肾脏功能水平，掩盖并延误病情。,实验验证,拟解决的问题,对当前酶法检测系统是否普遍存在干扰,临床状态干扰程度？对临床诊治的影响,干扰实验,体外添加实验,志愿者口服药物实验,临床服药患者血清干扰实验,1.羟苯磺酸钙的药代动力学-健康男性口服本品500mg后，约4h达血药浓度峰值，峰浓度约为13g/ml。在组织中分布广泛，与血浆蛋白结合率为20-25%，但不能透过血脑屏障。本品主要以原形从尿中排泄，口服后24小时内约有50%的药物从尿中排出，其中仅有10%为代谢产物。静脉给药本品500mg后5分钟，血浓达峰，峰浓为65g/ml。静注24小时内约有75%从尿中排出。其动力学特征符合二房室模型，相消除半衰期为4.1小时。,（一）体外添加实验,体外添加实验可行的前提,结论：（1）.所有现用肌酐检测系统均受外源性羟苯磺酸钙干扰，结果明显降低.（2）.随药物浓度增加降低幅度相应增加。（3）.不同检测系统干扰成都存在差异,二、志愿者口服药物实验,1.10名志愿者采集实验前基础空白血清采集服药前谷浓度血清采集服药后1h、2h、3h、4h、6h血清结果：不同试剂肌酐测定值与基础空白值偏差-6.4%至-28.5%，服药2h偏差为-24.9%至-60.5%。两种苦味酸法平均偏差2.1%和0.7%,口服连续三天（500mgtid）,再次口服500mg,（三）临床患者血清干扰评估,结论：无论是体外添加实验，体内实验还是患者追踪，均证实羟苯磺酸钙对酶法肌酐检测产生明显负干扰，且不同检测系统受干扰的程度不同。临床患者服药期间，若采用酶法检测肌酐可导致假性降低，降低的程度与服药后采血时间和采用的检测系统有关。,正在服用羟苯磺酸钙患者血清,HPLC法测定药物浓度,酶法和苦味酸法测定肌酐,其中10例与参考方法LC-IDMS/MS法比较,临床预警,建议采血时间-停药3-5d后，基本不受影响患者服药期间尽量在清晨空腹服药前采血若不能避免服药后采血，请重点关注肌酐、尿酸、尿素、胱抑素-C变化幅度。问题1.患者质疑药物的可靠性2.医生每次都要交代，医生忙、患者忘？3.酶法和苦味酸法需要同时开？重复检查问题怎么办？,