病毒血凝和血凝抑制试验.ppt

实验九质粒电泳病毒的血凝和血凝抑制,原理,与蛋白质分子类似，核酸也是两性解离分子。在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为8.08.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。,载样缓冲液,其中含有的甘油可以使待电泳样品沉在点样孔底部，避免样品漂浮其中含有的溴酚蓝（某些还含有二甲苯青）可以作为电泳速度度的指示分子，溴酚蓝的迁移位置大约相当于200bp左右的线性DNA分子的迁移位置。,溴化乙锭,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合无特异性。当染料分子插入后，导致与DNA结合的染料呈现荧光，DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处发射出来。溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。有一些低毒产品替代：sybrgreen、sybrgold、genefinder,电泳准备,用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放置电泳梳子。用1TAEbuffer配制琼脂糖凝胶(0.24gAgaros/32ml1TAEbuffer)，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。待溶液冷却至60，加入适量Goldview(或溴化乙锭)至微红，混匀。将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在5-7mm之间。在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1TAEbuffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面。,DNA电泳,取9l的DNA样品与1l的10*样品缓冲液（甘油，溴酚蓝，DNA稳定剂）混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品孔中。盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动。当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离（根据DNA的大小、1kb和3kb左右的指示剂来判断）后，切断电源，取出玻璃板，在紫外灯下观察，并拍照记录结果，估测质粒分子量的大小。,质粒DNA,3条带不是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。,一实验目的1:学会通过鸡胚接种增殖的病毒的收集2:掌握病毒血凝和血凝抑制试验的基本原理和基本操作3：理解病毒血凝和血凝抑制试验的应用,病毒的血凝和血凝抑制,二实验原理1:红细胞凝集某些病毒（如流感病毒，新成疫病毒，麻疹病毒等）拥有血凝素糖蛋白，可与人或某些动物的红细胞表面的相应受体结合，从而呈现红细胞凝集现象。在此，病毒与红细胞是配体与受体的关系，而不是颗粒性抗原与相应抗体作用的凝集反应。这种凝聚多种病毒都具有，不是完全特异的,2:红细胞凝集抑制当病毒被相应抗体中和后，则丧失了凝集红细胞的功能，即病毒的红细胞凝集特性被抑制。3:利用已知抗体，可通过红细胞凝集抑制试验鉴定某些具红细胞凝集特性的病毒，同样也可利用已知病毒抗原，通过红细胞凝集抑制试验来测定抗体水平，从而评价疫苗的免疫效果，或动物是否受到病毒感染血凝抑制试验是抗原抗体的特异性血清实验,4红细胞的解脱现象某些具红细胞凝集特性的病毒还拥有神经氨酸酶活性，其可使病毒从红细胞上解脱下来，因此，血凝试验的时间太长，可能会在高浓度孔见到类似阴性的反应结果，实验过程中必须控制好时间。,三实验操作(一)病毒的鸡胚接种与培养(二)病毒尿囊液的收集37度培养72小时的鸡胚-放置于4度冰箱,致死鸡胚-消毒气室-用镊子打开气室-打开壳膜-用移液器或吸管收集尿囊液于1.5毫升离心管-5000转,离心5分钟,以去除细胞沉淀-上清液供血凝和血凝抑制试验作用.(三)制备1%浓度的鸡红细胞采集新鲜的抗凝血,以生理盐水洗3次,每次离心5分钟,转速为4000转,最后用生理盐水配制成1%浓度.,(四)红细胞凝集试验1、50l的生理盐水加入96孔微量板A、B行的1-12孔。2、被检病毒液50l分别加入A、B行（一行为标准病毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍比稀释至第11孔，弃去50l，12孔为阴性对照。3、加50l的1%鸡红细胞于每一孔，按病毒的低浓度至高浓度加入。4、混匀、室温静止30min。5、确定红细胞100%凝聚的病毒的最高稀释度，为HA滴度。,6、血凝效价（HA）的确定将板直立，首先观察红细胞阴性对照，应呈逗点状。红细胞凝集孔呈颗粒状附于孔底。能凝集红细胞的最高稀释度即为血凝效价。,(五)4单位病毒液的配制以出现红细胞凝集现象的最高稀释度为1个单位,将原病毒液稀释成4倍于最高稀释度的病毒液,即为4单位病毒液.例如:出现红细胞凝集现象的最高稀释度是2的9次方(病毒的血凝效价为2的9次方),那么,4单位病毒液就为2的7次方.,(六)病毒的红细胞凝集抑制试验1、加生理盐水50l于96孔板的一排的1-12孔。2、加标准血清50l于一排第一孔，倍比稀释到第11孔，弃50l。3、将50l病毒的4个血凝单位抗原加至1到第11孔。4、然后加50l的1%鸡红细胞至各孔，混匀，室温静置30min。5、观察结果，确定血清的HI效价。血凝被抑制的抗体最高稀释度即为血清抗体的血凝抑制效价（HI效价）。,实验报告,实验目的实验原理实验步骤结果与分析思考题某一病毒能够引致血凝，是否可以判定它是何种病毒？如果不行，应该再要进行什么实验？为什么？下次实验血清学试验（凝聚试验和ELISA)p163,171,