板蓝根颗粒开发方案.ppt

板蓝根颗粒开发方案,姓名：张锐学号：1522210550015,目录,新药的发现,临床前研究,临床研究,申报及后续工作,基础和应用研究,发现并筛选药物来源,药学,药理学,毒理学,期临床试验,期临床试验,期临床试验,填写新药申请,后续登记活动,新药研发项目,IV期临床试验,一、前言,分类及症状中医分类：风寒型感冒（怕冷、发低热、无汗、头痛全身痛、痰稀、咳嗽痰为白粘痰，四肢酸痛、舌苔薄而润，脉浮）风热型感冒（高热、咳嗽痰为黄稠脓性痰，不怕冷，头痛，咽喉痛，舌苔微黄、口干、出汗多、舌苔白而干燥、脉浮数（较快）暑湿型感冒（高热、头晕脑涨、心中燥热，容易感到疲倦，无汗、口干，伴有呕吐、恶心，尿量少而黄，舌苔黄腻）西医分类：细菌性感冒、病毒性感冒,感冒,定义：感冒是由于上呼吸道感染引起的一种自愈性疾病，是包括鼻腔、咽或喉部急性炎症的总称，一般7d左右就会自行康复。,二、新药的寻找,板蓝根,板蓝根RadixIsatidis为十字花科植物菘蓝IsatisindigoticaFort.的干燥根，始载于神农本草经，已有2000多年的历史。中国药典1985年版开始收载。具有清热解毒、凉血利咽之功效，临床上常用于病毒性疾病及细菌感染性疾病。,作用：抗病毒（流感病毒、肝炎病毒、单纯疱疹病毒、其他种类病毒）抗菌（金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、流感杆菌、脑膜炎双球菌等）抗内毒素、抗炎、解热镇痛以及增强免疫等,板蓝根,板蓝根,化学成分1、有机酸类化合物吡啶三羧酸，顺丁烯二酸，2-羟基-1,4-苯二甲酸和羟甲基糠酸2、生物碱类化合物2.1吲哚类生物碱2,5-羟基吲哚，2,3-二氢-4-羟基-2-氧-吲哚-3-乙腈，吲哚-3-乙腈-6-O-D-葡萄糖苷，(E)-二氧羟苄吲哚酮2.2喹唑类生物碱3-(2-hydroxyphenyl)-4-(3H)-quinazolinone和isaindigotonet2.3其他类型生物碱依靛蓝双酮3、微量元素K，Ca，Mg，Zn，Fe，Cu，Mn，Pb，Hg，Ce,Co,Ni,Cd和As其中Ca,Mn,Zn,Fe含量较为丰富4、其他化学成分告依春、表告依春、1硫氰基-2-羟基-3-丁烯、(+)异落叶松树脂醇，2-羟基-3-丁烯基-硫氰酸酯，1-硫氰酸-2-羟基-3-丁烯，5羟甲基糖醛，正丁基-D-吡喃型果糖,板蓝根,三、临床前研究,板蓝根,新药临床前研究内容,药学评价药材产地、产量、提取路线和制剂工艺、物质基础及质量标准草案制订等。药理研究药效学、一般药理学、药代动力学及可能的作用机制研究。毒理评价急性毒性、长期毒性、特殊毒性（致畸、致癌、致突变）及其它毒性（刺激性、溶血、过敏、药物依赖性）研究。,一、药学评价,1板蓝根配方颗粒制备工艺的研究1.1药材种类板蓝根饮片。板蓝根又称北板蓝根，气微，味微甜而苦涩。1.2有效成分多数学者还是认可板蓝根中的有效成分为核苷类成分和表告依春。1.3提取工艺研究1.3.1提取方法：水提醇沉法由于表告依春是脂溶性成分，而腺苷是水溶性成分，所以为了最大限度的提高有效成分的含量，故采用先醇提再水提的提取工艺，增加了板蓝根中有效成分的含量和提取率。提取方式选择加热提取方法，即热提取法，且固液分离时应注意趁热滤过，使药效物质较少损失。1.3.2提取工艺路线确定：第一步选择乙醇作为提取溶剂，以醇浓度、液料比、提取时间为主要影响因素，通过单因素和响应面试验对醇溶液提取最优条件进行优化，以其有效成分（表告依春）的含量为考察指标；第二步选择水作为提取溶剂，选择药材的浸泡时间、加水量、提取时间及次数等以其核苷类（尿苷、鸟苷和腺苷）和表告依春的总含量为考察指标。,1.3.3分析方法的建立1.3.3.1色谱条件的确定1.3.3.2标准曲线的建立1.3.3.3精密度试验1.3.3.4稳定性试验1.3.3.5重现性试验1.3.3.6加样回收率试验1.3.4醇溶液提取工艺条件的研究1.3.5醇溶液提取最佳提取工艺的考察1.3.5.1响应面试验设计1.3.5.2提取工艺的验证性试验1.3.6水溶液提取工艺条件的研究1.3.6.1药材平均吸水量的考察1.3.6.2水提取工艺条件的考察1.3.6.3提取工艺的验证性试验,一、药学评价,1.4浓缩、干燥方法的确定药材提取后，药液与药渣采用120目滤布趁热滤过分离；减压浓缩法，浓缩至相对密度1.051.15（80）；采用喷雾干燥法干燥。1.5成型工艺条件的确定制粒方法、辅料、颗粒性质进行考察，最终确定最佳成型工艺。取板蓝根饮片，加入水1.5倍量，浸泡1h后，用70%乙醇（液料比=12：1），提取1次，时间为1h，滤过，药渣进行水提，每次加水8倍量，提取2次，每次1.5h，滤过，合并醇提水提的滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.051.1（580），喷雾干燥，加入糊精适量，干法制粒，干燥，整粒，即得。1.6工艺流程图1.7包装材料选择聚丙烯药品包装用复合膜袋1.8规格的确定1.5g/袋1.9七批小试样品试验研究板蓝根配方颗粒的制备工艺、成品质量稳定1.10三批中试样品试验研究板蓝根配方颗粒的制备工艺具有可行性及合理性。,一、药学评价,2板蓝根配方颗粒质量标准的研究采用薄层色谱（TLC）法对板蓝根配方颗粒有效成分表告伊春和腺苷进行了鉴别，采用高效液相色谱法（HPLC）对腺苷、鸟苷、尿苷、表告依春进行了含量测定，对板蓝根配方颗粒的质量标准进行进一步的提高及完善。2.1质量标准起草说明2.1.1药品名称2.1.2药材来源2.1.3性状本品为浅黄棕色至棕褐色的颗粒；稍有清香气，味微苦。2.1.4鉴别表告依春、腺苷的鉴别。2.1.5检查粒度、水分、溶化性、装量差异、重金属、砷盐、微生物限度2.1.6浸出物的测定2.1.7含量测定,质量标准：板蓝根配方颗粒每袋含板蓝根分别以其4种成分计，尿苷不少于0.1mg，鸟苷不少于0.1mg，表告依春不少于0.2mg，腺苷不少于0.1mg。,一、药学评价,3板蓝根配方颗粒初步稳定性的研究3.1考察内容样品的性状、鉴别、含量测定、水分、粒度、溶化性及微生物限度检查。3.2考察方法本药品为颗粒剂，试验方法采用加速试验和长期试验同时进行。3.3考察时间长期稳定性试验：0月、3月、6月，共3次。加速稳定性试验：0月、1月、2月、3月、6月，共5次。,“板蓝根配方颗粒”贮存条件为：密封“板蓝根配方颗粒”有效期为：18个月,一、药学评价,1板蓝根颗粒的药效学研究对甲型流感病毒小鼠的作用1.1动物：SPF级雌性BALB/c小鼠，80只，46周龄(体重1820g)1.2分组：小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、达菲组（阳性对照组）、板蓝根组4组。1.3剂量：板蓝根组的给药量为4.67g/(kgd)(参照临床剂量)，达菲组的给药量为0.03g/(kgd)。1.4方法1.4.1鼠的感染性:将小鼠乙醚吸入麻醉后，106TCID50（半数组织培养感染剂量）病毒液通过滴鼻途径感染小鼠，每只小鼠的接种剂量为50L，建立甲型流感病毒小鼠模型，对照组小鼠经鼻腔滴入等量的生理盐水。通过小鼠肺组织的PCR、肺组织病理结果可证实甲型H1N1病毒小鼠模型的成功建立。1.4.2给药:板蓝根组攻毒2h后灌胃给药200L、达菲组攻毒2h后灌胃给药200L，正常对照组及模型组灌胃给予生理盐水200L，每日1次，连续用药5d。,二、药理研究,1.5观察与检查1.5.1观察指标:用于观察板蓝根对感染小鼠肺组织的保护作用的小鼠共观察14d，记录小鼠的死亡数及生存天数，并计算存活率及延长生命率。用于观察板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染小鼠死亡的保护作用的小鼠在第5天安乐，取肺组织留做病理检查。1.5.2病理学检查:无菌取小鼠的肺，福尔马林溶液中固定24h，脱水，石蜡包埋、切片，常规HE染色，显微镜下下观察其病理变化。1.6结果1.6.1板蓝根颗粒对甲型H1N1流感病毒感染小鼠存活率的影响实验结果提示，板蓝根可明显降低甲型H1N1流感病毒感染小鼠的死亡率，与模型组比较差异显著(P0.05)，提示板蓝根对甲型H1N1流感病毒感染的小鼠有保护作用（表1）。1.6.2板蓝根颗粒对甲型H1N1流感病毒感染小鼠平均生存天数及延长生命率的影响实验结果提示，板蓝根可明显可延长小鼠的存活天数，与模型组比较差异显著，提示板蓝根甲型H1N1流感病毒感染的小鼠有保护作用(表2),二、药理研究,1.6.3病理学检查空白对照组动物肺脏均未见明显病理改变。阳性对照(模型)组动物感染甲型H1N1病毒第5天后肺脏呈弥漫性肺炎改变；阳性药(达菲)组部分动物(4例/10例)肺脏病变范围较模型组小，病变程度与模型组基本一致，其余动物(6例/10例)与模型组病变范围与程度基本一致；板蓝根颗粒组部分动物(2例/10例)肺脏病变范围较模型组小，病变程度与模型组基本一致，但其数量较阳性药(达菲)组少，其余动物(8例/10例)与模型组病变范围与程度基本一致。具体病变范围结果见表3,二、药理研究,1.7讨论板蓝根组可明显延长甲型H1N1病毒感染小鼠的存活天数，提高存活率，与模型组比较差异显著(P0.05)，提示板蓝根颗粒对甲型H1N1病毒感染致肺部病变具有减轻作用。,二、药理研究,2板蓝根抗病毒成分表告依春在大鼠体内的药代动力学2.1动物：SD大鼠,雌雄各半,体重250300g2.2分组：板蓝根溶液组2.3剂量：表告依春6.8mg/kg2.4方法2.4.1血浆中表告依春的测定2.4.1.1色谱条件2.4.1.2血浆样品处理2.4.1.3血浆中表告依春的工作曲线制备2.4.1.4回收率和精密度试验2.4.2动物试验SD大鼠6只,禁食12h,可自由饮水,给药剂量按表告依春6.8mg/kg进行给药。灌胃体积1mL/100g体重。给药前及给药后0.083,0.25,0.5,0.75,1,2,3,4,6,8,10,12,15h经眼球后静脉丛取血0.3mL,置肝素化试管中,离心取血浆0.1mL进行分析。给药4h后腹腔补充生理盐水1mL/100g体重。,二、药理研究,二、药理研究,2.4.2数据处理用矩量法求算药代动力学参数,即AUC用梯形面积法计算,tmax和cmax用实测值进行计算,用末端相浓度(3个点)对时间直线回归后求得末端消除速率常数Z,从而计算t1/2。并用t检验进行统计。,3毛细管电泳法研究板蓝根水提物抗流感病毒的作用机制显微镜检判定板蓝根不同处理方式下的红细胞经流感病毒侵染后的形态学差异,通过毛细管电泳结合显微镜镜检、血凝滴度指标进一步阐述板蓝根抗流感病毒的生化机制。结果:经过板蓝根保护过的细胞,能阻止病毒对细胞的吸附,推测其可能是通过与细胞膜的作用来保护细胞。结论:板蓝根通过结合到细胞膜上而起到保护细胞的作用,有效抑制了流感病毒对细胞的结合,从而达到抗病毒的目的。,二、药理研究,结论：板蓝根颗粒对感冒有一定的治疗效果。,三、毒理评价,急性毒性、长期毒性、特殊毒性（致畸、致癌、致突变）、局部用药毒性、过敏试验、刺激性试验、溶血试验药物依赖性试验,三、毒理评价,1板蓝根多糖的毒性试验1.1材料1.1.1板蓝根多糖的提取按照常规水煮醇沉法进行提取,使用前用双重蒸馏水配制成1ml含多糖0067g，高压灭菌，4冰箱保存备用。1.1.2试验动物清洁级昆明小白鼠。体重1822g，鼠龄为68周。雌雄各半。1.2方法1.2.1急性毒性实验及免疫器官指数的测定将板蓝根多糖用双蒸水配制成5个浓度，选取30只小白鼠(体重为202g)分成6组，每组五只，第六组为空白对照组，注射生理盐水，其余五组分别用上述不同浓度的板蓝根多糖腹腔注射，每只各2ml，相同饲养生活条件，饲养两周时间，观察小白鼠的活动情况，对参试小白鼠进行称重，采血检测红细胞、白细胞数。采血完毕后，即进行第一颈椎脱臼致死，打开腹腔，观察肝、肺、脾的形态学变化，并取出其免疫器官脾脏，用滤纸吸干血液后称重，计算出脾脏和体重之间的比值(即为脾脏指数)。通常用脾脏指数来反映机体的免疫功能，脾脏指数低则表示机体的免疫能力低下，反之则表示免疫功能增强。同时，采集肝脏、肺脏和脾脏制作组织切片，观察这些内脏器官的组织学变化。,三、毒理评价,所有小白鼠全部存活，且均未出现异常。,红细胞数无明显变化,白细胞数虽有所变化，但差异不显著,三、毒理评价,板蓝根多糖对机体脏器的影响,各组的小白鼠均未出现出血、充血等病理现象，随机抽取肺脏、肝脏、脾脏等样本制作切片均无病理变化，说明该浓度范围内板蓝根多糖对机体无明显毒副作用。,三、毒理评价,板蓝根多糖能够有效地提高小鼠脾指数，说明板蓝根多糖可以明显提高小白鼠机体的免疫功能。,三、毒理评价,小白鼠接受板蓝根多糖注射后，在此浓度范围内，浓度越高，E玫瑰花环形成率也越高。血液中T淋巴细胞的比率也就越高，免疫功能越强。,三、毒理评价,1.2.1玫瑰花环形成试验淋巴细胞悬液的制备:抓取小白鼠取血，每毫升加20IU肝素(200IU/mL肝素生理盐水溶液)抗凝。取抗凝血1mL，加入Hanks液1mL，混匀后加在1mL淋巴细胞分离液上，2500r/min，离心10min，吸出细胞悬液，用Hanks液洗涤2次，弃上清，将沉积细胞用pH74含10%小牛血清和HanKs液配成11062106个的细胞悬液。红细胞悬液的制备:新鲜采集的绵羊血液用生理盐水洗涤、配成1%的绵羊红细胞悬液。淋巴细胞与红细胞的作用:取01mL淋巴细胞悬液与01L绵羊红细胞悬液，置37水浴5min，500r/min，离心5min，置4冰箱12h。制片观察:取淋巴细胞与红细胞作用后的细胞悬液1滴放置玻片上，瑞姬染色3min，显微镜观察。凡一个T淋巴细胞吸附3个或3个以上绵羊红细胞的花结即为一个Et玫瑰花环，计200个淋巴细胞数，求出Et玫瑰花环结合率。,三、毒理评价,2板蓝根对试验性小鼠遗传毒性的影响2.1材料与方法2.1.1药品2.1.2实验动物昆明种小白鼠雌雄各半,体重1820g。ICR小鼠:雄性,体重1822g。2.1.3板蓝根水煎液的制备取干燥板蓝根10g,粉碎后放入500ml去离子水,浸泡30min;烧杯中煮沸30min,收集药液;再反复煎煮2次,收集3次药液,一起过滤去渣,沸腾水浴浓缩至10ml,使药液每毫升相当于生药量1g。4冰箱保存待用。2.1.4实验方法2.1.4.1小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验方法昆明种小鼠随机分为阴性对照组(生理盐水,腹腔注射);阳性对照组(30mgkg环磷酰胺,腹腔注射);中草药水煎液诱变组(分成人临床常用剂量的5、10、20倍组,灌胃给药)。每组4只动物,雌雄各半。,三、毒理评价,将中草药水煎液按所需剂量稀释成0.1ml只小鼠,各中草药水煎液诱变组灌胃给药,灌胃后36h颈椎脱臼法处死小鼠。阴、阳对照组分别腹腔注射生理盐水、环磷酰胺(0.1ml只小鼠),注射后24h颈椎脱臼法处死小鼠。各组动物参照改良Jagetia方法制片:常规方法取股骨骨髓腔细胞,制成小牛血清细胞悬液,常规涂片,空气晾干。甲醇固定,10%Giemsa染色。蒸馏水冲洗,干后镜检。每只动物观察2000个嗜多染红细胞,观察含微核的嗜多染红细胞数,计算其千分率。2.1.4.2小鼠精子畸形实验方法ICR小鼠阴、阳对照组同微核试验;中草药水煎液诱变组取10、2.5、0.5倍人临床常用剂量。每组6只雄性动物。将中草药水煎液按所需剂量稀释成0.1ml只小鼠,各中草药水煎液诱变组灌胃给药;同时阴、阳对照组分别腹腔注射生理盐水、环磷酰胺(0.1ml只小鼠)。隔日给药,连续3次。首次给药4周后颈椎脱臼法处死小鼠。各组动物参照Wyrobek方法制片:分离附睾,剪碎,滤除组织碎片,制成生理盐水悬液,常规涂片。气干后甲醇固定5min,2%伊红染色60min。蒸馏水冲洗,干后镜检。高倍镜下观察精子形态,每只动物检查首尾完整的精子1000个,按无钩、无定型、香蕉形、胖头和多头多尾分别记数畸形精子数及总的精子畸形百分率。,三、毒理评价,2.2实验结果2.2.1板蓝根的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果从表1可见,板蓝根各剂量组诱发的微核千分率与阴性对照(生理盐水)组相比,均具非常显著性差异(P0.01)。各剂量组之间未见显著性差异,未表现出明显的剂量-反应效应。,三、毒理评价,2.2.2板蓝根的小鼠精子畸形实验结果从表2可见,板蓝根各剂量组诱发的精了畸形百分率与阴性对照(生理盐水)相比,均具非常显著性差异(P0.01),且多头多尾精子所占比例明显增高。各剂量组之间未见显著性差异,未表现出明显的剂量-反应效应。各剂量组诱发的精子畸形类别及百分率与阳性对照(CP)组相比均无明显差异。,四临床研究,三、临床研究,1临床应用1.1呼吸系统疾病的应用。板蓝根在临床上多用于治疗病毒性感冒发热、咽喉肿痛、流行性腮腺炎、扁桃体炎和口腔溃疡等。1.2消化系统疾病的应用。板蓝根作为肝炎的传统用药,预防及治疗病毒性肝炎效果确切,可以用来治疗乙型肝炎病毒表面抗原携带者。另外,口服板蓝根冲剂可用于治疗复发性口疮、婴幼儿秋冬季腹泻及小儿肠炎。1.3皮肤及骨骼疾病的应用。治疗带状疱疹、玫瑰糠疹、扁平瘤、尖锐湿疣、单纯疱疹、肋软骨炎均有良效。另外,还可用银屑病、水痘、跖疣、寻常疣等的治疗1.4眼科疾病的应用。板蓝根注射液(每支2mL,相当于生药1g)点眼治疗流行性结膜炎,单纯疱疹病毒性眼病用板蓝根注射液2mL加入6mL生理盐水中配成13的点眼液,疗效好,无副反应。1.5其它。可用于治疗泌尿系统结石和病毒性心肌炎。,三、临床研究,1临床应用1.1呼吸系统疾病的应用。板蓝根在临床上多用于治疗病毒性感冒发热、咽喉肿痛、流行性腮腺炎、扁桃体炎和口腔溃疡等。1.2消化系统疾病的应用。板蓝根作为肝炎的传统用药,预防及治疗病毒性肝炎效果确切,可以用来治疗乙型肝炎病毒表面抗原携带者。另外,口服板蓝根冲剂可用于治疗复发性口疮、婴幼儿秋冬季腹泻及小儿肠炎。1.3皮肤及骨骼疾病的应用。治疗带状疱疹、玫瑰糠疹、扁平瘤、尖锐湿疣、单纯疱疹、肋软骨炎均有良效。另外,还可用银屑病、水痘、跖疣、寻常疣等的治疗1.4眼科疾病的应用。板蓝根注射液(每支2mL,相当于生药1g)点眼治疗流行性结膜炎,单纯疱疹病毒性眼病用板蓝根注射液2mL加入6mL生理盐水中配成13的点眼液,疗效好,无副反应。1.5其它。可用于治疗泌尿系统结石和病毒性心肌炎。,三、临床研究,三、临床研究,三、临床研究,三、临床研究,五、新药的申报与注册,五、新药的申报与注册,填写新药申请后续登记活动,Thankyou,