基因工程的基本操作程序演示文档

.,1.2 基因工程的基本操作程序,.,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,苏云金芽孢杆菌,抗虫基因,棉花植株(有抗虫特性),.,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用,载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。,.,一、目的基因的获取,.,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,调控遗传信息表达,上 游的RNA聚合酶结合位点:,基因结构,.,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的基因结构,.,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点等。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,.,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,转录,翻译,转录,翻译,.,1. 从基因文库中获取目的基因,1. 基因文库的概念:,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。,2. 基因文库的种类:,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,.,基因组文库与部分基因文库的关系,.,基因组DNA文库与cDNA文库,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,受体菌群体,与运载体连接导入,cDNA文库,某种生物某个时期的mRNA,.,基因文库的构建方法, 基因组文库的构建,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组文库,导入受体菌中储存,., cDNA文库的构建-反转录法：,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存,.,思考？,真核生物的基因用反转录法得到的cDNA与原基因相同吗？,.,真核细胞的cDNA的获取,编码区,非编码区,非编码区,DNA聚合酶,剪接有关的酶,RNA聚合酶,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含非编码序列。即不含非编码区和内含子,.,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,.,如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。,.,1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA B、线粒体DNAC、总mRNA D、tRNA,2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,.,2.利用PCR技术扩增目的基因,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,.,PCR技术的操作过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq聚合酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,.,模板DNA,.,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,.,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,.,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,.,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,.,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,.,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋边复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等,.,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA(即目的基因),反转录,合成,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,3、人工合成的目的基因,.,课堂练习,1、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,D,.,二、基因表达载体的构建 基因工程的核心,.,表达载体,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,.,基因表达载体的构建过程,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口两个黏性末端,.,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,.,课堂练习,2、有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,【拓展深化】工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在操作程序2中用到。,.,三、将目的基因导入受体细胞,转化：,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,.,1、目的基因导入植物细胞的方法,（1）农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,.,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,.,1、目的基因导入植物细胞的方法,（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞,操作方法：利用压缩气体产生的动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。, 钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um 。,适用：单子叶植物,.,1、目的基因导入植物细胞的方法,（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞, 特点:十分简便经济。,例：转基因抗虫棉,.,2、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？,.,3、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用方法：Ca2+处理获得感受态细胞过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态 细胞,感受态细胞 吸收DNA,表达载体与感受态细胞混合,.,小结：将目的基因导入受体细胞,.,四、目的基因的检测与鉴定,1、导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,2、目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,.,1、鉴定分子水平的鉴定,转基因生物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法,DNA分子杂交技术,变性,变性,.,1、鉴定分子水平的鉴定,变性,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物的mRNA,14N,14N,.,1、鉴定分子水平的鉴定,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,Bt毒素蛋白,出现杂交带,脱分化,组织培养,.,2、鉴定个体水平的鉴定,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,.,思考？,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,.,课堂练习,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,【拓展深化】只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对,.,课堂练习,即时应用(随学随练，轻松夺冠)4(2009年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达,D,.,练习5：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,a,a,.,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和 。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,基因枪法（花粉管通道法）,植物组织培养,脱分化和再分化,耐盐基因,一定浓度盐水浇灌,