荧光分光光度计的原理及应用.ppt

2019/12/18,荧光分光光度计的原理及应用,2019/12/18,一、分子荧光的产生,1.电子激发态的多重度单重激发态S：电子自旋方向和处于基态轨道的电子配对。,第一节荧光分光光度法原理,三重激发态T：电子自旋方向和处于基态轨道的电子平行。,2019/12/18,2.分子能级与跃迁基态(S0)激发态(S1、S2激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射。激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；,2019/12/18,2019/12/18,二、激发光谱与荧光光谱,1.荧光的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；,2019/12/18,2.荧光光谱,固定激发光波长,化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线(图中曲线II)。问题：荧光(磷光)的激发光波长如何选择？Stokes位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长。,2019/12/18,三、荧光强度和溶液浓度的关系,1定量依据荧光强度If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3I0lc=Kc（浓度高时如何？）,2019/12/18,标准曲线法定量：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法定量：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较。,2定量方法,三、荧光强度和溶液浓度的关系,2019/12/18,四、荧光、磷光分析方法的特点,（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高24个数量级；为什么？分光光度法所检测的是两个较大的信号的微小差别，荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少（4）可提供比较多的物理参数缺点：应用范围小。,2019/12/18,第二节荧光分光光度计的组成,测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器成直角。,基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：氙灯?和高压汞灯，染料激光器检测器：光电倍增管。,2019/12/18,仪器光路图,问题：参考光电管作用？,2019/12/18,第三节荧光分析法的应用,(1)无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析见表,2019/12/18,2019/12/18,2019/12/18,作业,P143,