甲胎蛋白基因的转录水平检测.ppt

甲胎蛋白基因转录水平的检测,组员：张晋华刘淼黄莉玲焦阳,Outline,实验目的实验方法及原理技术路线结果分析应用,一.实验目的,通过提取肝癌病人的癌细胞组织和癌旁组织，根据mRNA丰度的测定方法，从转录水平对AFP（甲胎蛋白）基因的表达进行检测,肝癌病人术中切取少量新鲜的肝癌组织及癌旁1cm的肝组织，迅速至-80冻存。,取材,目的,二.实验方法及原理,通过细胞RNA的提取技术，将定量的组织中的RNA提取出来，然后使用Northernblot技术，通过琼脂糖凝胶电泳、原位转移、放射自显影，测定AFPmRNA的丰度。,Northernblot:（诺瑟杂交）是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法。首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段,原理,三.实验技术路线,细胞RNA的提取,RNA的分离纯化,4.RNA转移和固定,琼脂糖凝胶电泳分离RNA,探针分子杂交,放射自显影,1.RNA的提取,TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。,TRIzol法,1.RNA的提取,匀浆处理:将组织在液氮中磨碎,100mg组织中加入1mlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。室温（15-30）放置5分钟。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。2-810000g离心15分钟。,1.RNA的提取,把水相转移到新管中。用0.5ml异丙醇沉淀水相中的RNA。室温放置10分钟。6.2-810000g离心10分钟，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，收集沉淀。7.用70乙醇洗涤RNA沉淀。至少加1ml70乙醇。2-8不超过7500g离心5分钟，弃上清。8.得到RNA。,2.RNA的纯化,RNA样品中不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除DNA分子的污染。,纯化要求,3.琼脂糖凝胶电泳,1、凝胶准备：用0.5TBE配制2琼脂糖凝胶。称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml0.5TBE；微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖；熔化的琼脂糖自然冷却到6070时，加入EB0.5g/ml，并轻轻混匀。,2、胶床准备：取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸，形成约58mm的挡墙。将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙。将胶床放在调整好的水平台上。,3.琼脂糖凝胶电泳,铺胶：将冷却致60的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度35mm。室温下静置1小时左右，凝胶固化。撕去胶床两端的胶带纸，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极。向电泳槽中加入0.5TBE电泳缓冲液，以越过凝胶表面12mm为宜。轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。原梳齿处(样品孔)即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。,3.琼脂糖凝胶电泳,上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般1030l。盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：电压15v/cm；时间1小时左右。电泳结束后，切断电源，取出凝胶。,电泳结果分析,紫外灯下观察RNA。测量从加样孔到各条带的距离。一RNA片段大小的对数值对迁移的距离作用，用得到的曲线课计算点杂交检测到的RNA大小,4.RNA转移和固定,Northern印迹,又称RNA印渍术，是将存在于凝胶中的RNA分子转移（印渍）于固定化介质(如：硝基纤维素膜)上并加以检测分析的技术，可以用合成的寡核苷酸片段作为探针，也可以用克隆或提取的DNA片段作为探针进行标记，特点专一性好，假阳性率低，用于RNA水平分析等。,4.RNA转移和固定,取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。室温下将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。室温下将胶浸到0.1mmol/LTrisHCl(pH7.5)中45min,使胶中和。20SSC洗胶1h。20SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。取出硝酸纤维素膜，80真空烘烤2h。,5.探针分子杂交,基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。（将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针）,根据美国PE公司提供的引物探针设计软件，设计的MGB探针序列如下：5（FAM）TACTGCAGAGATAAGTTT3（TAMRA）探针是由上海基康生物工程公司合成。,来自网络资料参考,6.显色,放射自显影：是一种利用放射性核素发射的核射线，使乳胶中的卤化银感光形成潜影，经显影和定影，形成图像。借助感光银颗粒所在部位和强度，能准确判断放射性示踪剂的分布部位和数量。,四.结果分析,五.应用,