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专题3、5,植物的组织培养技术、DNA和蛋白质技术,一、植物的组织培养技术1.菊花的组织培养,全能性,(1)理论基础：植物细胞的_。(2)基本过程,外植体,愈伤组织,长出丛芽生根移栽,(3)实验操作步骤,接种,移栽,制备MS培养基外植体消毒_培养_栽培,2.月季的花药培养,(1)理论基础：花粉具有_。,全能性,(2)花粉发育过程：_、_、_,等阶段。,四分体时期,单核期,双核期,(3)产生花粉植株的两种途径,植物组织培养所用的培养基为固体培养基。(,),二、DNA和蛋白质技术1.DNA的粗提取与鉴定,(1)实验原理,不同,0.14mol/L,不,蓝色,1)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度_，浓度为_时其溶解度最小。2)DNA_溶于酒精溶液。,3)DNA与二苯胺在沸水浴中呈_。,杂质,(2)实验步骤：选材、制备鸡血细胞液破碎细胞，获取含DNA的滤液去除滤液中的_DNA析出与鉴定。,2.血红蛋白的提取和分离,相对分子质量,(1)凝胶色谱法：也称分配色谱法，是根据_分离蛋白质的方法。相对分子质量较小的移动速度较慢，而相对分子质量较大的无法_，移动速度较快。(2)缓冲溶液：能够抵制外界的_对溶液pH的影响，维持pH_。(3)电泳：带电粒子在_的作用下发生迁移的过程。,进入凝胶内部,酸和碱,基本不变,电场,的大小,(4)实验操作1)样品处理及粗分离红细胞的洗涤血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液透析,2)凝胶色谱柱操作,凝胶色谱柱的装填,凝胶色谱柱的制作_样品的加入和洗脱3)纯度鉴定：用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。,3.多聚酶链式反应扩增DNA片段,(1)PCR原理,DNA模板,四种脱氧核苷酸,在一定的缓冲溶液中提供_、分别与两条模板,链结合的两种引物、_、,_，,同时控制温度使DNA复制在,_反复进行。,(2)PCR的反应过程：变性,_延伸。,耐热的DNA聚合酶,体外,复性,PCR扩增包括三个环节，变性、复性(退火)、延伸，这,三步的温度依次是(,),A,A95、55、72C55、95、72,B72、55、95D80、60、72,解析：PCR扩增的原理就是利用DNA耐高温的特性，使DNA在95左右双链解螺旋，然后在低温(3755)情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度(72)下，以引物3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。,考点,植物的组织培养,1.影响植物组织培养的因素(1)内部因素：材料的选取。(2)外部因素：营养成分的种类及配比；植物激素的用量及使用顺序；pH、温度、光照等。,2.获得成功的关键,(1)植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗逆性差，对,培养条件要求较高。,(2)培养材料一旦被微生物污染，就会导致实验失败。原因是微生物增殖快，生长迅速，消耗养分多，并产生代谢废物毒害培养材料。,(3)无菌技术主要包括对操作空间、实验用具、实验材料以,及操作者的消毒或灭菌。,3.植物激素在组织培养过程中的重要作用(1)使用顺序不同，结果不同,(2)用量比值不同(生长素比细胞分裂素)，结果也不同高：利于根的分化、抑制芽的形成。低：利于芽的分化、抑制根的形成。适中：促进愈伤组织的形成。,4.实验操作中应注意的几个问题,(1)材料的选取：菊花的组织培养实验中，应选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝；月季花药的培养实验中，应选择花粉发育过程中的单核靠边期的花粉进行培养。,(2)外植体消毒：所用的消毒剂是体积分数为70%的酒精和质量分数为0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。(3)培养过程：在初期，菊花的组织培养需光照，月季花药,的培养不需光照，而在后期均需光照。,单倍体育种与花药组织培养的区别,花药组织培养形成的是高度不育的单倍体植株；而单倍体育种则需要把对花药进行组织培养得到的单倍体植株诱导为染色体数目正常的纯合植株，以使其有正常的繁殖能力，再从中挑选出具有优良性状的个体。,【典例1】植物微型繁殖技术属于植物组织培养的范畴。,请回答下列问题。,(1)该技术可以保持品种的_，繁殖种苗的速度_。离体的叶肉细胞在适宜的条件下培养，最终能够形成完整的植株，说明该叶肉细胞具有该植物的全部_。,(2)把试管苗转接到新的培养基上时，需要在超净工作台上,进行，其原因是避免_的污染。,(3)微型繁殖过程中，适宜浓度的生长素单独使用可诱导试管苗_，而与_配比适宜时可促进芽的增殖。若要抑制试管苗的生长，促使愈伤组织产生和生长，需要使用的生长调节剂是_(填“脱落酸”或“2,4D”)。(4)将某植物试管苗培养在含不同浓度蔗糖的培养基上一段时间后，单株鲜重和光合作用强度的变化如下图。据图分析，随着培养基中蔗糖浓度的增加，光合作用强度的变化趋势是_，单株鲜重的变化趋势是_。据图判断，培养基中不含蔗糖时，试管苗光合作用产生的有机物的量_(填“能”或“不能”)满足自身最佳生长的需要。,(5)据上图推测，若要在诱导试管苗生根的过程中提高其光合作用能力，应_(填“降低”或“增加”)培养基中蔗糖浓度，以便提高试管苗的自养能力。,解题思路植物组织培养技术是利用植物细胞全能性的原理进行的，是植物细胞工程的基础。操作过程中应注意无菌操作，避免杂菌污染，因为培养过程中使用的培养基营养物质丰富；适宜浓度的生长素可以诱导试管苗生根，而如果要促进愈伤组织形成芽，则需要与细胞分裂素配比；促进愈伤组织产生和生长，应使用2,4D。,考点对应练1将无根的非洲菊幼苗转入无植物激素的培养基中，在适宜的温度和光照等条件下培养一段时间后，应出现的现象是,(,),B,解析：虽然培养基中没有激素，但幼苗叶片本身可以产生生长素，促进生根；而细胞分裂素的产生部位在根尖，所以细胞分裂素不能产生，所以植物能够在一定时间后长出少量的根而没有长出新芽。,考点,DNA的粗提取与鉴定,1.实验原理(1)DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，其变化曲线如下图所示。(2)DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的其他某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取含杂质较少的DNA。,(3)DNA二苯胺,蓝色(用于DNA的鉴定)。,2.实验流程,续表,3.实验关键,(1)取材不能用哺乳动物的血细胞(由于其成熟红细胞无细,胞核)。,(2)获取DNA时要向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便,使细胞膜和核膜破裂，把核内物质释放出来。,(3)实验中有6次搅拌，除最后一次搅拌外，前5次搅拌均要朝一个方向。并且在析出DNA、DNA再溶解和提取DNA中，各步骤搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。,(4)2次加蒸馏水,第一次加蒸馏水是为了使血细胞吸水膨胀破裂(注：植物,细胞是用洗涤剂溶解细胞膜)。,第二次加蒸馏水是为了稀释NaCl溶液，析出DNA。(5)3个浓度的NaCl溶液,2mol/LNaCl溶液，为了溶解DNA，使DNA与蛋白质,分离。,一个是0.14mol/LNaCl溶液，为了析出DNA。0.015mol/LNaCl溶液，目的是为了溶解DNA。,(6)DNA易吸附在玻璃容器上，所以实验中最好使用塑料烧,杯、试管、容器，以减少DNA的损失。,4.去除滤液中的杂质的其他方案,(1)方案一：用嫩肉粉(蛋白酶)，它能水解蛋白质，但对DNA,没有影响。,(2)方案二：加热至6075，大多数蛋白质不能忍受,6075的高温而变性，但DNA不变性。,【典例2】下列关于DNA粗提取与鉴定的说法正确的是,(,),A.析出DNA时要缓慢地加蒸馏水，当析出黏稠物时即不再加水B.在探究洗涤剂对植物细胞DNA提取的影响实验中，自变量是洗涤剂和食盐C.提取的DNA溶解后加入二苯胺试剂即可染成蓝色D.将含有DNA的滤液放在6075的恒温水浴箱中保温后过滤，能去除蛋白质杂质,解题思路DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低而析出，方法是用蒸馏水进行稀释，直至DNA析出量不再增加为止；探究洗涤剂对植物细胞DNA提取的影响实验中，自变量是洗涤剂；提取的DNA溶解后加入二苯胺试剂后要进行加热和分设对照组。,答案D,考点对应练2在DNA粗提取过程中，先后两次向烧杯中加入蒸馏水,的作用分别是(,),B,A稀释血液、冲洗样品B使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C使血细胞破裂、增大DNA溶解量D使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA解析：第一次是使血细胞破裂；第二次是降低NaCl浓度使DNA析出。,考点,蛋白质的提取和分离(以血红蛋白的提取和分离为例),1.样品处理(1)红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白，分离时采用低速短时间离心，直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。(2)血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯(溶解细胞膜)的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。2.粗分离(1)分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离下层的红色透明液体。,(2)透析：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL、物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h，去除样品中分子量较小的杂质。,3.纯化：利用凝胶色谱柱可对血红蛋白进行纯化。凝胶色,谱法分离蛋白质的原理，见下表：,4.纯度鉴定：使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(可,测定蛋白质的相对分子质量)。,DNA与血红蛋白的提取和分离过程比较,【典例3】(2011年南京一模)下列关于DNA和血红蛋白的,提取与分离实验的叙述中，错误的是(,),A可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪红细胞中提取到DNA和蛋白质B用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去部分杂质C透析法分离蛋白质的依据是利用蛋白质不能通过半透膜的特性D进一步分离与纯化血红蛋白可用凝胶色谱法、离心法、电泳法等,解题思路猪红细胞中没有细胞核，只能用于蛋白质的提取和分离实验中；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，低浓度和高浓度都可使DNA溶解，但在0.14mol/L的NaCl溶液中，溶解度最小，可析出DNA，从而去除部分杂质；透析法分离蛋白质的依据是蛋白质是大分子物质，不能通过半透膜，从而去除样品中分子量较小的杂质。,答案A,考点对应练3在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理,的目的是(,),D,A.防止血红蛋白被O2氧化B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能解析：利用磷酸缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于分离观察和研究。,考点,PCR反应的过程及结果,1过程(1)变性：当温度上升到90以上时，双链DNA解聚为单链。(2)复性：系统温度下降至50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸：当系统温度上升至72左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。,2.结果,(1)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、,复性、延伸。,(2)两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。,3.细胞内DNA复制与PCR技术的比较,【典例4】(2011年韶关模拟)多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：使模板DNA变性、解链复性(引物与DNA模板链结合)引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过,程的叙述中不正确的是(,),A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸DPCR与细胞内DNA复制相比，所需要酶的最适温度较高,解题思路变性的目的是破坏DNA分子内碱基对之间的氢键，让DNA解链，在体内可在解旋酶的作用下进行，体外则是高温；引物是脱氧核苷酸小片段，在复性时，能与DNA模板链结合；延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种脱氧核糖核苷酸；PCR是体外的DNA复制，需要高温才能让DNA解旋，所以要求酶的最适温度较高。,答案C,考点对应练4PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏,水使用前必须进行的关键步骤是(,),C,A.反复洗涤B加热消毒C.高压灭菌D在20储存解析：通过对PCR实验中所用仪器和试剂进行高压灭菌，可以避免外源DNA等因素的污染。,1(2012年惠州三调)下列有关生物实验材料的选用正确的,是(,),B,A.观察线粒体时可用榕树叶肉细胞代替口腔上皮细胞B.提取DNA时可以用花椰菜也可以用鸡血C.西瓜汁中无还原性糖，不能代替梨汁做还原性糖的鉴定D.用样方法调查种群密度时可以用蔓生的紫藤作调查对象解析：榕树叶肉细胞有颜色，不能用于观察线粒体；西瓜汁中有颜色，不能代替梨汁做还原性糖的鉴定；蔓生的紫藤难以计数。,2(2011年广东)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确,的是(,),D,A.洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D.在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢解析：D项考查凝胶色谱法分离蛋白质的原理，相对分子质量越大的蛋白质通过凝胶色谱柱的速度越快。,3(2009年广东)材料：饲料原料中的磷元素有相当一部分存在于植酸中，猪、禽等动物由于缺乏有关酶，无法有效利用植酸，造成磷源浪费，而且植酸随粪便排除后易造成环境有机磷污染。植酸酶能催化植酸水解成肌醇和磷酸，因此成为目前重要的饲料添加剂之一。(1)商品化植酸酶主要来自微生物。在产酶菌株筛选过程中，常在基本培养基中添加不溶于水的植酸钙制成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产生_，可根据其大小选择目的菌株，所得菌株需要进一步测定植酸酶活性。活性测定可以植酸钠作为底物，活性可用一定条件下单位时间_,_表示。,透明圈,消耗量(肌醇和磷酸的生成量),植酸钠的,(2)利用上述所得菌株制备植酸酶的流程如下图：,中的主要成分为_；中包含植酸酶等多种蛋白质。请写出一种纯化得到植酸酶的方法及其依据。_,_,_。,小分子杂质,凝胶色谱法：根据蛋白质之间分子大小、吸附性质等差异进行纯化(或电泳法：根据蛋白质之间电荷、分子大小等差异进行纯化),(3)为建设基因工程菌，可用PCR等技术从上述菌株中克隆植酸酶基因。PCR反应包含多次循环，每次循环包括三步：_。反应过程中打开模板DNA双链的方法,是_。,变性、复性和延伸,加热,(4)除植酸酶外，微生物还应用在_,_的生产中。,蛋白酶、脂肪酶、,纤维素酶,
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