PCR仪原理及其应用.ppt

PCR仪的原理及其操作应用,1.PCR仪的技术原理2.PCR仪的分类与应用3.PCR仪的操作步骤,轻纺与食品学院报告人：裴乐乐指导老师：林教授,1.PCR原理简介PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应，主要用于DNA片段的体外扩增，基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。,PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(94oC),TargetSequence,TargetSequence,PCR原理示意图,模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,PCRCycle-Step2Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences,TargetSequence,TargetSequence,Primer1,Primer2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCRCycle-Step3-At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated,TargetSequence,TargetSequence,Primer1,Primer2,5,3,5,5,3,5,3,3,TaqDNAPolymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的DNA链。,Endofthe1stPCRCycleResultsintwocopiesoftargetsequence,TargetSequence,TargetSequence,每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,TargetAmplification,No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,824,1cycle=2Amplicon,2cycle=4Amplicon,3cycle=8Amplicon,4cycle=16Amplicon,5cycle=32Amplicon,6cycle=64Amplicon,7cycle=128Amplicon,2.PCR仪的分类与应用,普通PCR仪：一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，如果要做不同的退火温度需要多次运行。梯度PCR仪：一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度），因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间。,原位PCR仪：用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪，如病源基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增。实时荧光定量PCR仪：在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量PCR仪。其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同，只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。,普通PCR,梯度PCR,原位PCR,荧光定量PCR,四种PCR仪示意图,3.PCR的操作步骤1.配置反应体系：引物、模板、buffer，dNTPs,酶，Mg2+,(如果是荧光定量PCR，则还有染料或探针）。2.在PCR仪上设置程序：一般是94变性5min使模板充分变性,之后“94变性、退火（不同引物温度不同）、72延伸”共30-35个循环，再72延伸10min，使产物延伸完整，设置完程序后启动机器运行。3.如果是常规PCR，则后面还有电泳实验，如果是荧光定量PCR则可以实时观察实验过程。,PCR反应,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,PCR反应,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数,最近自己做的PCR扩增实验1.提取样品中酵母菌的DNA2.配置好体系后用普通PCR仪进行扩增(所用引物是EF3和EF4)3.做琼脂糖凝胶电泳实验，并用凝胶成像仪观察DNA条带用到的PCR扩增程序：(1)945min(2)9445s511min722min设置第二步共30个循环，最后72保持10min,PCR扩增程序设置,凝胶成像仪下DNA条带图示,Thanksforyourtime!,