琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤.ppt

琼脂糖凝胶电泳Agarosegelelectrophoresis,天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。,琼脂糖（agarose）半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷,D-半乳糖,核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段,1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.样品易回收，常用于制备。,琼脂糖凝胶电泳的优点,缺点1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。,一、实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法,DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。,DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。,二、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。,琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。,溴化乙锭（EthidiumBromide,EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。,三、实验材料、器具及药品质粒DNA样品。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTBE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓冲液,四、实验步骤1g琼脂糖加入100ml1TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60，加入100l的0.5mg/mlEB，并摇匀。）,用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固。,充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。,用移液器吸取总DNA或质粒样品4l于封口膜上，再加入2l的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。,打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。,将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。,将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。,123M,1、DNA分子的大小双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；2、琼脂糖浓度浓度越低，相同核酸分子迁移越快；3、DNA的构象同一分子：超螺旋环状线状切口环状,DNA的迁移速率决定因素,4、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。5、所用的电压低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。6、琼脂糖种类常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；,不同类型琼脂糖的性质,不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围,常用的电泳缓冲液,4保存备用.,7、电泳缓冲液,TAE和TBE电泳缓冲液比较,都是常用电泳缓冲液，二者相比：1）TAE的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；2）TBE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE中迁移快10%；4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。,凝胶载样缓冲液,载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2）使样品带有颜色便于简化上样过程；3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。,6凝胶载样缓冲液,琼脂糖凝胶中DNA的检测,通过染色,紫外灯下检测。主要采用溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）染色法。,使用EB染色注意事项,（1）EB被认为是一种强致癌物质（2）EB可用来检测单链或双链核酸（3）EB使用时的配制、贮存及使用EB常用水配制成10mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5g/ml。（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。,凝胶中DNA的成像,可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。,关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法几点注意事项,1）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。2）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、数目及样品孔形状与容量。3）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。4）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于Southern印迹转移和需要回收DNA片段的电泳，则应该每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。）,5）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降，这在酶切质粒与空白对照质粒一起电泳时应值得注意。6）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与DNA泳动的方向相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中溴化乙锭含量低，会对含量较少的小分子DNA片段检测困难。处理方法是：将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色3045分钟。7）判断正负极的另一方法是负极气泡（H2）比正极气泡（O2）多一倍。,