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,6.1微生物发酵与制药6.2微生物生长与生产的关系6.3制药微生物生产菌种建立6.4培养基制备6.5灭菌工艺6.6发酵培养技术6.7发酵工艺过程的控制6.8青霉素的生产工艺,第六章微生物发酵制药工艺,青霉素的概述生产菌的生物学特性发酵工艺过程提炼工艺过程,6.8青霉素的生产工艺,1929:Fleming在葡萄球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药物。1939：牛津病理家HowardFlorey化学家ErnstChain,NormanHeatley。发酵瓶培养霉菌，培养里提取，测活性，青霉素结晶。,6.8.1概述发现（1）,1940:8只鼠注射链球菌，提取物对4只治疗。未经治疗鼠在24小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。1941年2月开始治疗第一批人类病人。1943：威斯康辛大学小组，取得突破生产菌表面培养：几十个单位。深层培养产黄青霉：100U/ml。X、UV诱变育种：10001500U/ml。不产色素变种：6600070000U/ml目前：85000U/ml。,细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。生长中的细胞有效，静止细胞无效高效、安全的抗细菌感染药物,6.8.1概述作用机理（2）,（1）临床抗感染治疗：大多数革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体等。毒性小，但需要皮试。（2）各种半合成抗生素的原料：氨苄青霉素，磺苄青霉素，乙氧萘青霉素头孢菌素母核。,6.8.1概述应用（3）,6-氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic6APA）苯乙酰衍生物。侧链基团不同，形成不同的青霉素G：苄基青霉素，C6H5CH2-CO-，为主双氢霉素F：戊青霉素X：对羟苄基青霉素F：2-戊烯基青霉素K：庚青霉素V：苯氧甲基青霉素产品：钠、钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺,6.8.1概述分子结构及衍生物（4）,产黄青霉：Penicilliumchrosogenum孢子:绿色和黄色菌落：平坦或皱褶，圆形。青霉穗:分生孢子链状深层培养菌丝：球状和丝状两种。,6.8.2青霉素生产菌的生物学特性,第1期：分生孢子萌发，具有小泡。第2期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒。第3期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性很强。第4期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素。第5期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。第6期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨，pH上升。第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。,发酵培养下的生长过程及细胞学变化,规定时间取样，显微镜观察7个时期的态变化，控制发酵。14期为菌丝生长期，3期的菌体适宜种子。45期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。第6期到来之前结束发酵。,镜检控制,青霉素生产流程框图,斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基进行培养米孢子：移植到小米或大米固体培养基上，生长7天，25注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。,6.8.3发酵工艺过程,一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。空气流量1：3（体积比）；300-350rpm；pH自然，温度271,40h二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，251。10-14h质量：菌丝致密，菌丝粗壮，III期，倍增期6-8h,2、种子罐培养工艺,三级罐：生产罐；接种量20培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.参数条件：通气量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小时:pH6.4-6.6，26；60小时后:pH6.7,24。,3、生产罐培养工艺,操作方式：反复分批式发酵发酵罐：100M3，装料80M3.带放:6-10次，带放量10，间隔24h。发酵周期：180-220h,4、发酵培养与过程控制,青霉素的生产周期,发酵动力学,前40小时：培养基中的主要营养物40小时后：低速连续补加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。半饥饿状态：延长合成期，提高产量。碳源占成本12以上，采用糖化液流加,降低成本。糖与6APA结合形成糖基-6APA，影响青霉素产量。,（1）过程控制补料分批操作控制基质浓度,根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。残糖0.3-0.6左右，pH开始升高时流加糖。浓度：500kg/M3，流速:1.0-2.5kg/M3.h,流加碳源控制,玉米浆:最好，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。补加无机氮源：硫酸铵、氨水、尿素氨基氮浓度：0.01-0.05%。,流加氮源控制,无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁对青霉素合成有毒，30-40ug/ml以下。罐壁涂环氧树脂保护层。,盐离子控制,时期：合成阶段种类：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸毒性：抑制细胞生长和青霉素合成。策略：低浓度流加浓度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%控制：保持供应速率略大于生物合成需要。,（2）添加青霉素侧链前体,表面活性剂：新洁尔灭、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他：剪切保护剂；分散剂,提高产量的其他物质流加,适宜菌丝生长温度30，分泌青霉素20。20青霉素破坏少，周期很长。变温控制，不同阶段不同温度。生长阶段:较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。前期控制26左右，后期降温控制24,（3）温度控制,合成适宜pH6.46.6左右，避免超过7.0直接加酸或碱：自动控制流加葡萄糖：恒速；变速，依赖pH变化快慢。pH下降：补加CaCO3、通氨、尿素或提高通气量pH上升：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）,（4）pH控制,30饱和度，产率急剧下降；10，造成不可逆的损害。临界溶氧浓度：30。通气比：1：0.81.5。适宜的搅拌速度:保证气液混合，提高溶氧调整搅拌转速:各阶段的生长和耗氧量不同。,（5）溶氧控制,天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影响呼吸代谢。,（6）消沫,青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定易溶于有机溶剂，水中溶解度很小青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性防止降解，条件温和、快速。,2.8.4提炼工艺过程,青霉素的存在部位：发酵液浓度较低：1030Kg/M3含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白,1、预处理,鼓式真空过滤机过滤：一次滤液：pH6.2-7.2，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量0.5-2.0%。板框式过滤机过滤：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土为助虑剂。二次滤液：澄清透明，用于提取（收率90）,2、过滤,原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而霉素盐易溶于水。萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白质：加0.05-0.1%乳化剂PPB。萃取：23次。,3、溶剂萃取,正相萃取：酸化pH1.8-2.0，滤液：醋酸丁酯1：0.3，碟片式离心机分离（浓缩1.5-2.1）反相萃取：pH6.8-7.4（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。反复萃取23次，达到结晶要求。萃取条件：10下。萃取罐冷冻盐水冷却。,逆流萃取过程,萃取液中添加活性炭，除去色素过滤，除去活性炭。,4、脱色,加醋酸钠乙醇溶液反应：得到结晶钠盐。加醋酸钾乙醇溶液：得到青霉素钾盐。,5、结晶直接结晶,萃取液，再用0.5MNaOH萃取pH6.4-6.8下得到钠盐水浓缩液。加3-4倍体积丁醇，16-26，真空0.67-1.3KPa）下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥（60真空16h），磨粉，装桶，得到青霉素产品。,5、结晶共沸蒸馏结晶,青霉素的概述生产菌特性发酵工艺过程提炼工艺过程,小结,（1）青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义？（2）如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制？（3）青霉素发酵过程的控制原理及其关键点是什么？（4）青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作，为什么？,思考题,
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