《细菌的遗传分析》PPT课件.ppt

第六章细菌的遗传分析,真核生物基因分离、自由组合及连锁交换均通过有性过程(减数分裂受精)实现。细菌和病毒均属于原核生物不存在严格意义上的有性过程。,但细菌细胞内除了染色体外还有一些寄生性复制因子(如噬菌体和质粒，也被称为核外或染色体外因子)，它们可以在细胞间传递，并且形成细菌染色体间以及细菌染色体与核外遗传因子间的重组体。这种重组体结构类似于真核生物减数分裂过程中形成的重组体结构。,第一节细菌的细胞和染色体,一、细菌细胞细胞比较小，仅含有1-2条染色体，每条附着在细胞膜上的一定区域，无核膜，称拟核。细菌每20分钟繁殖一代二、细菌染色体大都是双链DNA环状结构，长度从2535000不等，裸露，无蛋白质结合，也不形成核小体，所以其染色体的显著特点是：易于接受带有相同或不同物种的基因或DNA片段的插入。大肠杆菌染色体DNA以折叠或螺旋状态存在，且依赖于RNA分子的作用。,第二节大肠杆菌的突变型及筛选,一、大肠杆菌的突变类型（一）合成代谢功能的突变型（anabolicfunctionalmutants):合成代谢功能(anabolicfunction):野生型（原养型）品系在基本培养基上具有合成所有代谢和生长所必须的复杂有机物的功能。营养缺陷型：一个必需的基因发生了突变不能进行一个特定的生化反应，从而阻碍整个合成代谢功能的实现。条件致死突变,（二）分解代谢功能的突变型（catabolicfunctionalmutants):条件致死突变型。分解代谢功能（anabolicfunction）：野生型大肠杆菌能利用比葡萄糖复杂的不同碳源，因为它能把复杂的糖类转化成葡萄糖或其他简单的糖类，也能把复杂分子如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间产物。这些降解功能称。同样，一系列降解功能的实现也需要许多基因的表达，其中任何一个基因突变都会影响降解功能的实现。,（三）抗性突变型：细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗菌素产生抗性。二、突变型的筛选营养缺陷型的筛选、鉴定：选择培养法是根据菌株在基本培养基和营养（补充）培养基上的生长表现将菌株分为原养型(也称为原生营养型)与营养缺陷型(在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长)。其它突变类型的筛选、鉴定：对于其它的突变类型(如温度敏感型)，也可以通过培养条件的选择培养来筛选与鉴定。,选择培养法一次可鉴定、筛选一种突变型，但要检测分离含有多种突变型的混和菌株，仅采用选择培养法要进行多次试验才能够达到目的、效率太低。为高效检测、分离混和群体中不同突变型，黎德伯格夫妇设计了影印培养法。该方法原理与选择培养法一致，但是采用影印法将在完全培养基上单菌落同时接种到不同选择培养基上同时对所有菌落进行选择培养，鉴定效率大大提高。,注意：(1)最初的培养基必须是非选择性的，即各种突变型都能够在其上生长；(2)必须采用适当的方法如涂布或划线法，以使培养物菌落之间要分开。,影印培养法：,三、细菌基因的统一写法,1.基因座位写法,（1）用三个缩写字母表示,（2）都用小写字母,（3）都用斜体字母,（4）用右上角字母或符号表示野生型（+）、突变型（-）、抗性（r）或敏感性（s）。,如：gal+、gal-,（1）用三个缩写字母表示,（2）第一个字母用大写字母,（3）都用正体字母,（4）用右上角字母或符号表示野生型（+）、突变型（-）、抗性（r）或敏感性（s）。,如：Gal+、Gal-,2.表型的写法,（5）如果一个基因座位内部有多个基因位点，在座位的后面用正体大写字母表示,如：lacZ、lacY等,二、酵母菌基因的统一写法,1.基因座位写法,（1）用三个缩写字母表示基因功能,（3）都用斜体字母,（2）基因后面用数字表示不同的基因座位。,如：GAL4，CDC28,2.基因产物的写法,基因符号的正体字形式,如：GAL4，CDC28,四、细菌中常用的基因符号,第三节大肠杆菌的性别,传统上将这部分内容放在细菌的接合（conjugation）一节。,一、大肠杆菌性别的发现,1.E.coli接合的发现,1946年JoshuaLederberg和EdwardTatum发现了细菌之间通过直接接触传递遗传信息。,Lederberg由于研究细菌的重组而获得1958年NobelMedicineorphysiologyPrize。,Tatum和G.W.Beable提出的“一个基因一个酶”也在此奖中。,（1）Lederberg-Tatum实验,菌株,Tatum的K12菌株（当时并不知道含有F因子）。,具有多重营养缺陷型（multiple-auxotroph）突变：,Astrain：met-bio-thi+leu+thr+,Bstrain：met+bio+thi-leu-thr-,都只能在完全培养基（completemedium）中生长。,Lederberg发明的用基本培养基（minimalmedium）筛选原养型（prototroph）方法。,实验过程,对照（control）,对实验结果的解释,Lederberg和Tatum从概率上和对照实验上排除了细菌发生恢复突变的可能性：,a）单一性状恢复突变率是10-7，双性状恢复突变的概率是10-14。,结论：,在A菌株与B菌株之间发生了遗传物质的交换。,b）对照培养的A、B菌株都没有生长出菌落。,2.对Lederberg-Tatum实验解释的质疑,（1）实验获得的原养型重组菌可能是转化的结果。,（2）培养基中含有某些代谢产物，混合后互相补充了对方的缺陷而得以生长。,3.Lederberg和Tatum的补充试验,A（或B）菌株,基本培养基中培养,细菌滤器过滤,滤液,B（或A）菌株,基本培养基中培养,不能生长,4.BernardDavis实验的支持,1950年Davis的U形管实验证实不同菌株的杂交需要细胞的直接接触。,5.杂交菌株的作用的区分,1952年WilliamHayes和LucaCavalli-Sforza在重复Lederberg-Tatum实验时发现：,用高剂量的链霉素处理A、B菌株对杂交会产生不同的影响。,（1）Hayes实验,strainA,链霉素,strainB,strainA,杂交转化,（2）实验推论,strainB,链霉素,strainA,strainB,不能杂交转化,链霉素只阻止细菌分裂，但允许接触杂交。,供体：,strainA虽然被阻止分裂，但仍然能完成杂交（给出DNA），结果产生分裂形成的原养型菌落。,（3）Hayes的意外,结论异宗配合（heterothallic）：,strainB被阻止分裂，也仍然能完成杂交（接收DNA），但不能分裂形成原养型菌落。,受体：,用在冰箱放了一年的一个A菌株（链霉素敏感性的供体）与B菌株杂交，结果不产生原养型重组菌落！,两个菌株在杂交过程中的作用不是相互的。,（4）Hayes对意外的A菌株的“修理”,strainA（strs）冰箱保存一年,strainB（strs）,不产生原养型菌落,?？,strainA（strs）冰箱保存一年,strainA（strr）,诱变、筛选,strainA（strs）,strainA（strr）,Hayes的结论：,strainA（strs）在冰箱中放置了一年，从“雄性”变成了“雌性”。,不久，Lederberg和妻子也发现了这种现象。,strainB（strs）,strainA（strr）,产生原养型菌落,（5）Hayes等对“雄性”细菌和“雌性”细菌的解释,（1）供体（donor）菌株：（fertility）,（2）受体（recipient）菌株：,“雄性”是由于细胞内含有一种致育因子（fertilityfactor）。表示为F+。,“雌性”菌株缺乏F因子。表示为F-。,从逻辑上预言了F因子（Ffactor）的存在。,6.F因子的实质(04D,3,31),是一种质粒（plasmid）。,（1）质粒（plasmid）,存在于细菌染色体以外的DNA。对细菌的生存并非必须，但能给细菌带来一些额外的功能（如抗菌素抗性等）。,（2）Ffactor,共价闭合环状DNA，全长94.5kb。,Ffactor的几个特点,有4个插入序列（insertionsequence，IS）。,功能：,通过和宿主染色体上的IS同源序列重组（或转座）使F因子整合到宿主染色体上。,宿主染色体上的IS方向不同，使F因子整合的方向随之不同。,IS1,IS3,IS2,（3）F因子的组成,重组区,自主复制区,有转移起点和两个复制起点。,oriT,inc,oriV,功能：,oriT是染色体转移时进行滚环复制的起点，oriV是独立复制的起点。,转移区,包含约40个基因，合成F纤毛（性伞毛）的操纵子。,G,H,F,C,B,E,L,A,Y,7.F因子传递,1957年拍到了第一张细菌接合照片。但当时对F因子并不太了解。,8.高频重组菌株（Hfr）,1950年LucaCavalli-Sforza用氮芥（nitrogenmustard）处理A菌株，从存活下来的菌中分离到一株能与B菌株以10-4频率杂交的菌株，称之为Hfr（highfrequencyrecombination）。,是一种F+。,F+F-,F+,HfrF-,F-,低频率重组,10-7,高频率重组,10-4,9.高频重组与F因子的关系,（1）Hfr与Ffactor的异同处：,都能与F-杂交,杂交时都要通过接合的形式,高剂量的链霉素处理不影响杂交,产生的重组菌落的频率不同,F+F-的后代是F+；HfrF-的后代是F-,F+经丫啶橙处理变成F-；而Hfr经丫啶橙处理仍为Hfr，能与F-杂交,相同点,不同点,（2）Hfr的形成,F因子整合到染色体上。,（3）Hfr的传递,（4）Hfr重组频率高于F因子的原因,Hfr接合后染色体基因进入受体菌，但一般在F（整合的）进入受体前，结合管就断裂了。结果是F-。,Hfr接合后染色体基因进入受体菌，重组（能筛选的标记）的概率是10-4。,独立的F因子的菌株整合进入染色体成为Hfr的概率是10-3。,F只有先整合到染色体上形成Hfr（10-3），Hfr才能将染色体基因送入受体重组（10-4）。所以通过F因子被检测到重组（10-7）。,A,A,Hfr,F+,F-,10-3,10-4,使F-变成F+,F+,F-,使F-变成F+,F+传递A基因的频率10-7,10-7,A,A,A,Hfr,F-,10-4,A基因转入的频率10-4,A,Hfr传递A基因,第四节中断杂交与重组作图,一、中断杂交实验原理基因从Hfr细胞按次序转入F-细胞，可根据基因进入F-细胞的时间和次序制作基因图谱。Wollman和Jacob于1954年在大肠杆菌中曾进行了以下杂交实验：Hfr：thr+leu+azsTislac+gal+strsF-:thr-leu-azrTirlac-gal-strr把接合中的细菌在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以中断接合中的细菌，然后分析受体菌的基因型，这是在大肠杆菌等细菌中用来测定基因位置的一种方法。,Wollman和Jacob想了解Hfr品系在杂交时，什么时候把基因转移给F细菌，他们把两个品系进行杂交,问题1：如何确定基因转移的顺序和时间?混合培养液进行通气培养，每隔一定时间取样，把菌液放入搅拌器内搅动以打断配对的接合管，使接合的细胞分开以中断杂交然后检查某一基因是否发生重组。,问题2：如何检出某一基因的重组子?把中断杂交的细菌放在完全培养基上培养，显然供体、受体菌都能生长。影响检别，我们只需要把发生重组的重组子检出。这就必须有一个可供选择用的供体标记基因。这样可以认出重组子，如在基本培养基中培养选择thr+leu+重组子。这时thr+leu+为标记基因，可排除受体菌株，但供体菌还能继续存在。为了不选择供体细胞本身，供体细菌也应该带有一个特殊的标记，能使自己不被选择。例如供体菌对链霉素敏感，这样当结合体在含有链霉素的培养基上生长时，供体菌株就被杀死了。,因此，把中断杂交的细菌稀释接种到含有链霉素的基本培养基上，如能形成菌落，它的基因型必定是thr+leu+strr。因为只有这种重组子才能生长。并说明供体thr+和leu+已进入受体并发生重组。我们称在供体菌中被选择的基因thr+和leu+为选择标记，而始终不被选择的strs为反选择标记基因，而那些还没有进行选择检定的基因为非选择标记。,问题3：在发生重组的菌落中，如何检别非选择标记基因。对每一时刻的重组thr+leu+strr的菌落影印培养接种到不同的培养基上（如乳糖lac+伊红红，gal+美兰红色）。记录重组子中每一非选择标记出现的时间、出现的频率和持续时间，得右图（Hfr的非选择标记基因进入F-所需的时间，以及根据非选择标记在各个时间出现的频率作图）。,从图中可以看到，从Hfr菌株的基因在F-细菌中出现的开始，随着时间的增加，具有这一基因的菌落逐渐增加，直到某一频率为止。而且某一基因出现的时间愈早，它达到的频率愈高。,解释：因为基因在染色体上，从染色体的一端开始，以线性方式按一定的时间顺序依次进入F-细胞，始端称为原点（origin）或0。显然，基因离开原点越远，进入F-细胞越迟。离开原点较远的基因，可能在转移过程停止以前，仍未转移，因而频率较低，达到的最高值也较小。根据以上实验，如果以转移的时间单位（每分钟）作为基因间的距离单位，就可以作出Hfr染色体上的基因分布图。如果杂交持续2小时，然后中断交配，就会发现一些细胞转变为Hfr。这说明致育因子是最后转移到受体，是染色体的最后单位。所以频率很低。,二、中断杂交法作图（06A2/4）,1961年，EllieWollman和FrancoisJacob又建立了另一种绘制E.coli遗传图的方法：,1.中断杂交（interruptedmatingtechnique),Hfr与F-杂交，在混合后的不同时间进行搅拌，使接合管断裂，终止染色体向F-细胞移动。,2.作图原理,越是排在前面的基因进入F-的机会越多，重组率也越大。在不同的时间中断,3.实验结果,杂交，根据不同基因的重组率就能推断出基因的顺序。,HfrH,strsthr+leu+azistonrlac+gal+,strrthr-leu-azirtonslac-gal-,F-,(2)选择标记：strsthr+leu+,(1)菌株,(3)其他基因出现时间：,中断杂交不同取样时间非标记基因的重组率,azir（10分钟）；tonr（15分钟）；lac+（20分钟）；gal+（25分钟）,4.基因排列顺序图,0,5,10,15,20,25,起点,thr/leu,aziton,lac,gal,（min）,5.E.coli的染色体是环状的,Wollman和Jacob用4个不同的Hfr菌株同F-进行中断杂交，得到的基因排列顺序相同，但是进入的时间早晚（重组率）不同。,（1）不同的Hfr菌株中断杂交的结果,（2）解释,i）Hfr染色体上F因子的整合位点不同，整合方向也不同。,ii）传递的起始点不同。,iii）E.coli的染色体是环状的。,（3）E.coli染色体图（以分钟为单位）,1963年，中断杂交法绘制,mapunitsinminutes,四、细菌的重组频率和遗传作图,（一）、传递等级绘图,1956年Wollman、Jacob和Hayes用E.coliK12的Hfr进行了重组试验。,1.亲本菌株,HfrH：,thr+leu+azislac+gal+()-strsmal+mtl+,thr-leu-azirlac-gal-()+strrmal-mtl-,F-,（1）,thr+leu+strr,thr+leu+azislac+gal+()-strsmal+mtl+,thr-leu-azirlac-gal-()+strrmal-mtl-,（2）,gal+strr,双交换,thr+leu+azislac+gal+()-strsmal+mtl+,thr-leu-azirlac-gal-()+strrmal-mtl-,双交换,2.选择标记,3.实验过程,Hfr,F-,str,选择培养基,（1）第一次选择培养基：,（1）加入str，但不加Thr和Leu；,（2）加入str，但不加Gal；,混合,能在选择培养基上生长的菌株一定是thr+leu+strr或gal+strr,第一次选择得到的重组菌再进行Lac等其他标记的选择。,如：能在不加lac的培养基中生长的一定是thr+leu+strrlac+或者gal+strrlac+,（3）计算第二次选择标记的出现频率,（2）二次选择：,第二次的菌落数第一次的菌落数,100%,4.实验结果,thr+leu+strrlac+,Lac的重组率:,thr+leu+strr,100%=49%,xyl：木桐糖,mtl：甘露醇糖,5.推理作图,实验结果表明：,第二次选择的标记的出现频率显示了不同的等级:离第一次选择标记越近的，出现的频率越高。,可以利用第二次选择标记出现的频率来代表它与第一次选择标记基因的距离进行遗传作图。,重组的特点:1、形成部分二倍体（partialdiploid）或部分合子（merozygote）2、只有偶数次交换才能产生平衡的重组子。3、相反的重组子不会出现。,图示：(1)单交换产生不平衡的线性染色体。(2)双交换产生有活性的重组子和片段，片段以后在细胞分裂中失去，所以重组子不会出现。,在中断杂交中，根据基因转移的先后次序，以时间为单位求出各基因间的距离，叫做时间作图法。如果基因间转移的时间在两分钟以内，用这种方法求得的基因间距离就不很精确可靠，重组作图是根据基因间重组率进行定位的。接合重组作图的特点：（与减数分裂生物的区别）(1)不用亲本类型(i)无法区分，(ii)不重组将丢失。(2)两对基因间的交换频率，必须在形成部分二倍体的条件下，计算重组率。(3)部分二倍体如果不发生重组，无法鉴别。只有最后一个基因进入受体细胞，长并发生重组才能鉴别，即最后一个基因发生重组的条件下，计算两基因的重组率。(4)接合重组不产生相反的重组类型。例如根据中断杂交试验知lac和ade基因是紧密连锁的而且lac比ade先进入受体。,试验：Hfrlac+ade+strsF-lae-ade-strr混合60分，链霉素基本培养基。未杂交的被杀死。选出来的都是ade+strr。因为ade+是在lac+之后进入F，所以，lac自然进入，形成了部分二倍体。在ade后部发生了交换，但另一交换位置需进一步鉴别。将重组子菌落影印培养在EMB（曙红+美蓝）培养基上，如果是紫红色，说明重组子含有lac+ade+，另一交换发生在lac前端，如果粉红色，说明交换发生在lac和ade之间，为lac-ade+重组子。lac+ade不会产生。,用时间单位法lac-ade的图距是一分钟，所以时间单位和重组值的关系大致是1分钟=20%的重组值,第五节F因子与性导,一F因子与F菌株HfrF+因子的时候，F因子偶尔可能获得细菌染色体的一部分,而保留着对遗传地点的“记忆”。这种带有部分细菌染色体的F因子称F因子。当F因子再整合到细菌染色体时，它就只能在原来的地点配对、交换而插入其中，而不能象F因子那样可以在任何位点整合。F菌株：指带有F因子的细菌。,二、性导F因子转入受体细胞后，由于引入体细胞的部分基因，从而形成部分二倍体，这种利用F因子将供体细胞的基因导入受体形成部分二倍体的过程叫性导（sexduction或Fduction）,第六节转化与转导作图,一、转化(transformation)(一)、细菌转化实验(二)、转化过程*(三)、共同转化与遗传图谱绘制,一、细菌转化实验,1.基础知识野生型肺炎双球菌(Strep-tococcuspneumoniae)菌落为光滑型，一种突变型为粗糙型，两者根本差异在于荚膜形成；荚膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原性；不同抗原型是遗传的、稳定的，一般情况下不发生互变。,2.Griffith转化研究(1928),Griffith对其试验结论及发展根据上述研究结果Griffith认为：(有毒)死细菌中的某种物质转移到(无毒)活细菌中，并使之具有毒性，导致小家鼠死亡。他将这种细菌遗传类型的转变称为转化，并将引起转化的物质称为转化因子(tranformingprinciple)。但是当时的化学与生化分析技术还无法鉴定杀死细菌中的成分，因而不知转化因子为何物。,以后一些研究者重复上述试验，并且加入了体外培养试验，即：将加热杀死的SIII细菌与无毒RII细菌混合培养，然后注入小家鼠体内，同样导致家鼠死亡。表明：细菌在培养条件下也能够实现遗传类型间的定向转化。,3.阿维利(Avery)等的转化实验(1944),实验结论上述实验结果表明：来源于加热杀死的SIII细菌，并使RII细菌转化成为SIII型细菌的转化因子是DNA。正是在这一认识的基础上，将转化定义为：某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。,Avery等人的实验实际上也表明：决定细菌遗传类型的物质是DNA，即证明了DNA就是遗传物质。但由于他们采用的实验方法当时不被人们广泛接受，而且得出的结论与当时人们的传统观念(认为蛋白质是遗传物质)不符合，而长期没有得到人们的承认。,(二)、转化过程转化现象在细菌中是一种普遍现象。不同细菌转化过程有一定差异，但是它们都存在几个共同特征，即：1.感受态与感受态因子：感受态指细菌能够从周围环境中吸收DNA分子进行转化的生理状态。,感受态主要受一类蛋白质(感受态因子)影响，感受态因子可以在细菌间进行转移，从感受态细菌中传递到非感受态细菌中，可以使后者变为感受态。一般认为感受态出现在细菌对数生长后期，并且某些处理过程可以诱导或加强感受态，以大肠杆菌为例，用Ca2+(如CaCl2)处理对数生长后期的大肠杆菌可以增强其感受能力。,2.供体(donor)DNA与受体(receptor)细胞结合(binding)：结合发生在受体细胞特定部位(结合点)；对供体DNA片段有一定要求(20000个核苷酸对）；结合过程是一个可逆过程。3.DNA摄取：当细菌结合点饱和之后，细菌开始摄取外源DNA；往往只有一条DNA单链进入细胞(单链摄入)，另一条链在膜上降解。,4.联会(synapsis)与外源DNA片段整合(integration)：整合就是指单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换，从而稳定地掺入到受体DNA中的过程。实际上就是一个遗传重组的过程。因而研究整合的分子机制事实上也为遗传重组的分子机制作出了贡献。,具体过程包括几个连续的阶段：(1)双链DMA分子和细胞表面受体部位进行可逆性结合。(2)供体DNA片断被吸入受体细胞，并要防止受体DNA酶的破坏。(3)供体DNA进入受体后，立即从双链DNA转变成单链DNA，其中一条单链被降解。(4)未被降解的一条单链DNA部分地或整个地插入受体细胞的DNA链中，形成杂合的DNA分子。(5)这种杂合DNA复制，分离以后，形成一个受体亲代类型的DNA和一个供体与受体DNA结合的杂种双链DNA。从而导致基因重组，形成各种类型的转化子（transformant）。图示：转化中单链外基因组片与双链内基因驵间整合过程。(6)供体单链与受体DNA之间结合形成一段异源双链区。转化过程的最后结果取决于误配核苷酸对的修复校正。如切除供体单链，则无重组发生。如切除受体单链则产生重组体，如果无校正作用发生，则该细菌经DNA复制和细胞的分裂产生一个有受体基因型的细胞，一个具有重组体基因型的细胞。,从一个供体菌株分离出来的DNA与另一受体菌株活细胞接触，大约只有1%的受体细菌细胞可吸收外源DNA，并发生遗传性的转化。转化频率低的原因可能是：(1)只是在特定区域形成临时性通道受体部位。数目有限。(2)还必须有酶，或蛋白质分子以及能量等的协同作用。能接受外源DNA分子并被转化的细菌细胞称为感受态细胞；而促进转化作用的酶或蛋白质分子称为感受态因子。,*(三)、共同转化与遗传图谱绘制,利用共同转化绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理：相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离间成正向关系，基因间距离越近，发生共同转化的频率越高，反之越低。因此可以通过测定两基因共同转化的频率来指示基因间的相对距离。(P158),（1）连锁关系的确定观察DNA浓度降低时的转化频率的改变。因为在较低的浓度范围内，转化频率和转化DNA的浓度成正比关系。如果A和B是连锁的，那么当DNA浓度下降时，AB同时转化频率下降和A或B转化频率下降程度相同；如果A和B并不连锁，那么AB转化频率下降将远远超过A或B转化频率下降的程度。,（2）Nester等用枯草杆菌的一个菌株作为供体trp2+，his2+,try1+，提取其DNA向受体trp2,his2,try1，菌株进行转化，结果如表65。,转化基因间重组值的计算,转化子数(重组体数)亲组合数+转化子数,例:供体trp2+his2+tyr1+trp2-his2-tyr1-P158表6-5的重组值trp2his2的重组值=34%trp2tyr1的重组值=40%his2tyr1的重组值=13%根据重组值作图：trp234his213tyr1,重组值=,(+-)+(-+)(+)+(+-)+(-+),二转导与作图,一）、转导的发现,1952年，J.Lederberg和他的学生N.Zinder在鼠伤寒沙门氏菌（salmonellatyphimurium）中作的重组实验：,1.菌株,StrainLA-2：,phe+trp+met-his-,StrainLA-22：,phe-trp-met+his+,2.杂交结果,StrainLA-2：,StrainLA-22：,10-5Prototrophs,phe+trp+met+his+,3.DavisU-tube实验,将两个亲本分别放在U形管两臂中，结果同样能获得原养型重组菌！而且只在LA-22中！,高频？,4.解释,一种可以通过细菌虑片的因子把遗传信息从LA-2传给了LA-22。,他们称之为FA（filterableagent）,5.WhatistheFA?,（1）进一步实验的观察,LA-2产生FA时要求LA-22的存在。,LA-2,单独培养,培养基,LA-22,不能重组,过滤,（2）推论,FA不是裸露的DNA,加入DNase并不能减弱FA的效力。（排除了转化）,FA不能穿过噬菌体虑片。,鼠伤寒沙门氏菌LA-22中有温和噬菌体P22,LA-22中的原噬菌体P22偶然裂解，穿过滤片后感染并裂解LA-2，包装了LA-2的基因，返回滤片感染LA-22并溶源化。给LA-22带入phe+trp+。形成原养型。,穿过滤片,原养型,LA-22(+P22),P22,偶然溶菌,P22,感染LA-22,LA-22重组,感染LA-2,偶然包装LA-2基因,P22,P22,定义：以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。,2.转导的种类,完全普遍转导普遍转导流产普遍转导转导低频转导局限转导高频转导,过程：供体菌正常噬菌体+完全缺陷噬菌体少量裂解物+大量受体菌遗传稳定的转导子,（1）普遍性转导（generalizedtransduction）,定义：通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。1.1完全(普遍性)转导：completetransduction。1952年发现，在Salmonellatyphimurium中存在转导现象。在它的完全普遍性转导实验中：以其野生型菌株作为供体菌营养缺陷型菌株作为受体菌P22噬菌体作为转导媒介，对供体菌是烈性噬菌体，对受体菌是温和噬菌体,裂解,完全普遍转导,（1）普遍性转导（generalizedtransduction）,过程：P22在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（106108）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的缺陷噬菌体。供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，使其感染复数（m.o.i）1，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内。,在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。,感染复数（m.o.i，multiplicityofinfection）:,感染复数由于每一宿主细胞表面的特异性受体有限，因此所能吸附的噬菌体数目也有一个限量。每一敏感细胞所能吸附的噬菌体的数量,m.o.i一般很大，可达250360。由于超m.o.i的外源噬菌体吸附而引起的、不能产生子代噬菌体的裂解，称为自外裂解（lysisfromwithout）。,噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况：1）包入的完全是噬菌体的DNA（正常噬菌体）2）包入的完全是细菌DNA（完全缺陷噬菌体）3）部分带有噬菌体基因的DNA（部分缺陷噬菌体）转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。,噬菌体裂解第一个宿主,普遍性转导过程,一个稳定的转导子的形成,第一次交换第二次交换交换完成，外源DNA掺入染色体组中,1.2流产普遍性转导（abortivetransduction）,概念：受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释，,所以，能在选择性培养基平板上形成微小菌落就是流产转导的特点。,2.局限性转导,定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。特点：噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率（约105）“误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成（约形成50%缺陷噬菌体）分类：低频转导与高频转导,转导的过程,该溶源菌被诱导裂解时，有极少数（105）的前噬菌体（prophage）发生不正常切离（abnormalexcesion），其结果会将插入位点两侧之一的少数宿主基因（如E.coli前噬菌体的两侧分别为发酵半乳糖的gal基因或合成生物素的bio基因）连接到噬菌体DNA上（而噬菌体也将相应的一段DNA遗留在宿主的染色体组上），通过衣壳的“误包”，就形成了一种特殊的噬菌体缺陷噬菌体（defectivephage）。它们没有将宿主溶源化的能力，而是使宿主成为一个局限转导子，对噬菌体没有免疫性。,温和噬菌体感染受体菌后，其DNA会开环，以线状形式整合到宿主染色体的特定位点上，从而使宿主细胞发生溶源化，并获得对相同温和噬菌体的免疫性。,特异性转导过程,噬菌体在大肠杆菌中的插入位点att（attachmentsite）称为attB或att，位于gal与bio基因之间。,插入,正常环出,异常环出,溶源性转导,重组性转导,一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的（104106）。把这种裂解物称为LFT（低频转导）裂解物。用LFT裂解物以低m.o.i（感染复数）感染宿主，就可获得极少量的局限转导子，即低频转导。,2.1低频转导（LFT，lowfrequencytransduction）,E.coliK12Sgal-/dgal+/（双重容源菌供体）(50%)+dgal+（50%）E.coliK12Sgal-(受体菌)E.coliK12Sgal-/dgal+（转导子）,（双重容源转导子）,高频转导和低频转导图解,低频转导,高频转导,U.V.,U.V.,双重容源菌【E.coliK12(/dg)】,转导噬菌体（dg）+辅助噬菌体（）,转导子菌落,噬菌斑,U.V.,附,当用LFT裂解物以高m.o.i感染E.coligal（不发酵半乳糖的营养缺陷型）菌株时，凡是感染有dgal噬菌体任一细胞，几乎都同时感染有正常的噬菌体。这时与dgal同时整合在一个受体菌的核染色体组上，从而使它成为一个双重溶源菌（doublelysogen）。当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常噬菌体的基因可补偿dgal缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。所以在双重溶源菌中的正常噬菌体被称为助体（或辅助）噬菌体（helperphage）。双重溶源菌的裂解物中含有等量的和dgal粒子，称为HFT（高频转导）裂解物。用HFT裂解物以低m.o.I感染另一个E.coligal（不发酵半乳糖的营养缺陷型）受体菌，就可以高频率地把它转化为能发酵半乳糖的E.coligal+转导子。是为高频转导,2.2高频转导（HFT，highfrequencytransduction）,三、共转导与细菌作图,thr,leu,azi,共转导率大，基因之间的距离近。,实验1：leu离azi近。,thr,leu,azi,或,实验2：thr离leu近。,实验3：thr与leu中间无azi。,五、普遍转导作图,一般借助2或3个基因的共转导，分析重组菌（转导子）中存在或缺少那些供体标记基因。计算共转导率，推理作图。,a+b-c+,供体：,a-b+c-,受体：,选择标记：a+，共1000个转导子,例：,（1）ab的共转导率,来自供体菌的b-转导子：,501+244=745,所有的来自供体的a+转导子：,12+243+501+244=1000,ab的共转导率=,745,1000,100%=74.5%,（2）ac的共转导率,ac的共转导率=,12+501,1000,100%=51.3%,（3）bc的共转导率：（a+）,来自供体的b-c+转导子：501,bc的共转导率=,501,1000,100%=50.1%,（4）三个基因之间的位置关系,a+b-时多为c-；a+c+时多为b-。说明b在ac之间。,a,b,c,abac=bc,（5）基因位置推定,共转导率,ac=bc说明：当ac都转导过去时，b也同时过去了。a是第一选择标记，选到的bc转导子同时也一定是a+）,作图,普遍性转导和局限性转导的比较,