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1.2基因工程的基本操作程序,与RNA聚合酶结合位点,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,1、编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。,2、非编码区：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。,一、原核细胞的基因结构（补充知识）,二、真核细胞的基因结构（补充知识）,编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,与RNA聚合酶结合位点,1、编码区,2、非编码区：调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、终止子），不编码蛋白质。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的表达和检测,基因工程的基本操作程序,基因工程的目的基因编码蛋白质的基因。,与生物抗逆性相关的基因与优良品质相关的基因与生物药物和保健品相关的基因与毒物降解相关的基因与工业所需酶相关的基因具有调控作用的因子,3、人工合成,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,(基因比较小，序列已知),聚合酶链式反应,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,按照外源DNA片段的来源：从特定组织提取的染色体基因组DNA-基因组文库（总）mRNA反转录成的cDNA拷贝-cDNA文库（部分）,基因文库的目的,在不知目的基因序列的情况下，获得所需的目的基因。,基因文库的分类,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1)基因组文库(Genomiclibrary),是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,cDNA(complementaryDNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库,2)cDNA文库(cDNAlibrary),基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,?,cDNA文库中含启动子、内含子吗？,编码区,启动子,终止子,外显子(能编码蛋白质),内含子(不能编码蛋白质),真核细胞的一个基因的编码区转录出mRNA前体，需把其中的内含子切除，外显子拼接成成熟mRNA。,真核细胞的基因结构,?,cDNA文库和基因组文库的比较,从基因文库获取目的基因,根据目的基因的有关信息，如：基因的已知核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA；基因的表达产物蛋白质,（二）利用PCR扩增目的基因,1、过程,高温变性（解旋为单链）,低温退火（引物与单链互补结合）,适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）,重复循环,引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。,引物：,dNTP：,三磷酸脱氧核糖核苷酸，包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dUTP等在内的统称，N代表变量指代A、T、G、C中的一种。,DNA的基本单位脱氧核苷酸,dNTP核苷酸的衍生物,高能磷酸键一定是有能量的，dNMP没有这两个高能磷酸键，会要消耗更多的外源能量。,2、条件,已知基因的核苷酸序列、,四种脱氧核苷酸、,引物,TaqDNA聚合酶,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,4、结果,耐高温,3、方式：以指数方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,2n,适宜的温度和PH值,PCR扩增仪,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,TaqDNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,（3）人工合成目的基因,DNA合成仪,基因工程的核心,1、目的：所需物质：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,它们各自的作用是什么?,二、基因表达载体的构建,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因：作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,将目的基因导入受体细胞,转化,1、将目的基因导入植物细胞,适用于双子叶植物裸子植物,农杆菌转化法,适用于单子叶植物,基因枪法,花粉管通道法,适用于被子植物,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,3、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：,四、目的基因的表达和检测,接种实验,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂交法,DNA分子杂交法,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA分子杂交,DNA-RNA分子杂交法用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若出现杂交带，表明目的基因转录出了mRNA,第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。,抗原抗体杂交法,
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