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选修一生物技术实践,选考内容,第二讲微生物的培养和应用,1培养基(1)概念：人们按照微生物对_的不同需求，配制出供其_的营养基质。(2)营养构成：一般都含有_和无机盐。此外还需要满足微生物生长对_、氧气以及_的要求。(3)种类：按照物理性质可分为_培养基和固体培养基。,考点一微生物的分离与培养,营养物质,生长繁殖,水、碳源、氮源,pH,特殊营养物质,液体,2无菌技术(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止_的方法。(2)关键：防止_的入侵。(3)不同对象的无菌操作方法(连线),杂菌污染,外来杂菌,称量,灭菌,倒平板,接种,常用的微生物接种方法有两种a平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面_，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。b稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的_，然后将_的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。(3)菌种的保存方法对于频繁使用的菌种，可以采用_的方法。对于需要长期保存的菌种，可以采用_的方法。,连续划线的操作,梯度稀释,不同稀释度,临时保藏,甘油管藏,判断下列说法的正误。(1)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。()(2)培养基分装到培养皿后进行灭菌。()(3)从有机废水中分离分解有机物的微生物时，接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养。()(4)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。()(5)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。(),(6)下图中甲为平板划线中最重要的环节，乙为操作的结果：每一次划线后都要将接种环灼烧。()除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端。()(7)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落。()(8)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(),提示(1)获得效果A的接种方法为稀释涂布平板法，获得效果B的接种方法为平板划线法。(2)最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灭菌。,1培养基配制(1)培养基的成分,(2)培养基的分类,(3)牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备,高考警示(1)培养基的配制原则目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等选择原料配制培养基，如培养自养型的微生物就不用加入有机营养物质。营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。,(2)微生物对主要营养物质的需求特点不同种类的微生物代谢特点不同，因此对培养基中营养物质的需求也不同。自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。,2纯化微生物的接种方法(1)两种接种方法的比较,(2)平板划线操作的注意事项操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：,灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。划线时最后一区不要与第一区相连。划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。,3消毒和灭菌的辨析,有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染，某同学欲从污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以_为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于_培养基。(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即_和_。,原油,选择,平板划线法,稀释涂布平板法,(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力_。(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、_和_。无菌技术要求实验操作应在酒精灯_附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。解析(1)选择性培养基的特点是在培养基中加入某种化学物质，以促进所需要的微生物的生长，而不需要的微生物无法生长。本实验的目的是筛选出可以分解原油的高效菌株，因此在筛选的时候选择性培养基的碳源为原油。,强,干热灭菌,高压蒸汽灭菌,火焰,(2)纯化微生物的方法有两种：平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。,(3)分解圈是原油分解之后，菌株周围形成的无原油的透明圈。菌株降解能力强，周围原油被分解得多，分解圈大。(4)获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的污染。灭菌的方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。酒精灯火焰附近温度高、无菌，因此实验操作应在其附近进行。,正确判断培养基制作与接种操作是否合格的方法(1)从培养基制作是否合格上判断：如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。(2)从接种操作是否符合无菌要求上判断：如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合接种菌菌落的特点，说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，重新操作。,技巧点拨,变式训练,A,解析缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长，而固氮细菌能生长；在培养基中加青霉素可以抑制细菌和放线菌等原核生物细胞壁的合成，而霉菌属于真核生物，能生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长，对放线菌的生长无影响。,一土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)分离原理土壤中细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成_，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到_作用。(2)统计菌落数目统计样品中的活菌一般用_法。,考点二微生物的筛选和计数,脲酶,催化,稀释涂布平板,(3)实验流程土壤取样_微生物的培养与观察细菌的_。2分解纤维素的微生物的分离(1)纤维素酶组成：纤维素酶是一种_，一般认为它至少包括三种组分，即_。作用：,样品的稀释,计数,复合酶,C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,纤维二糖,葡萄糖,红色复合物,透明圈,刚果红,透明圈,纤维素,实验流程土壤取样：富含_的环境。选择培养：用_培养，以增加纤维素分解菌的浓度_：制备系列稀释液。涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。挑选产生_的菌落。,纤维素,选择培养基,梯度稀释,透明圈,判断下列说法的正误。(1)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。()(2)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。()(3)纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，在纤维素酶的作用下，纤维素可以水解成葡萄糖。(),(4)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。()(5)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中，选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度。()(6)刚果红染色法只能在培养微生物的时候加入刚果红。()(7)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素(),研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落如图1所示，并用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同的温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见图2，请分析：,(1)透明圈是如何形成的？(2)图中透明圈大小代表什么？降解纤维素能力最强的菌株是哪种？(3)结合图2推测哪种菌株更适合用于人工瘤胃发酵？提示(1)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，形成透明圈。(2)透明圈大小与纤维素酶的量和活性有关，降解纤维素能力最强的是菌株。(3)J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高，更适合用于人工瘤胃发酵。,1选择培养基的选择方法(1)在培养基中加入某种化学物质：例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以分离出金黄色葡萄球菌。注意：这里的加入是在主要营养成分完整的基础上加入。(2)改变培养基中的营养成分：例如，缺乏氮源时可分离出固氮微生物；石油作为唯一碳源时可分离出消除石油污染的微生物。(3)改变微生物的培养条件：例如，将培养基置于高温环境中培养，可得到耐高温的微生物。,2筛选分解尿素的细菌与分解纤维素的微生物的比较,3.微生物的计数(1)两种计数方法的比较,(2)设置对照和重复,4.微生物的筛选与鉴别方法(1)微生物的筛选方法：单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。鉴定培养法：利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。,(2)微生物的鉴别方法：菌落特征鉴别法：根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。指示剂鉴别法：如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。,高考警示“选择菌落数在30300的平板”的两个提醒用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30300的平板进行计数。解题时易出现以下误解：(1)只得到1个菌落数在30300的平板是错误的。错误的原因是不符合实验的重复原则，易受到偶然因素的影响。(2)得到3个或3个以上菌落数在30300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：,不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30300”，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。可见，并不是只要得到3个“菌落数在30300的平板”即可，而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30300的平板”且无较大差异，说明实验操作合格，才能按照计算公式进行计算。,D,解析制备培养基时，需要将培养基用高压蒸汽灭菌，A正确；接种方法为稀释涂布平板法，即需要制备不同的土壤稀释液后才能倒平板，B正确；对照组和实验组需要放置在恒温培养箱中培养，C正确；一般选择菌落数在30300的平板进行计数，D错误。,2(2014全国卷，39)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将_分解成_。(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成_色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的_。,变式训练,纤维二糖,葡萄糖,红,透明圈,(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：注：“”表示有，“”表示无。据表判断，培养基甲_(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_；培养基乙_(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_。,不能,液体培养基不能用于分离单菌落,不能,培养基中没有纤维素，不会,形成CR纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌,解析(1)纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质，能被土壤中某些微生物分解利用；分解纤维素的纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即CX酶、C1酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)根据有无琼脂成分可推知，培养基甲为液体培养基，培养基乙为固体培养基；纤维素分解菌分离和鉴别要用固体培养基，培养基甲不符合要求；培养基乙不含纤维素粉，不能形成特定的红色复合物，乙培养基不符合要求。,课末总结,思维导图,(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生_。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_(答出两点即可)。,探究高考明确考向,脲酶,分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物,为细胞生命活动提供能量，为,其他有机物的合成提供原料,(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择_(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是_。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有_(答出两点即可)。,尿素,其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用,NH4NO3，不能起到筛选作用,为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定,2(2016四川卷，10)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。,(1)图中选择培养基应以_为唯一氮源；鉴别培养基还需添加_作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成_色。(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是_，每克土壤样品中的细菌数量为_108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较_。,尿素,酚红,红,稀释涂布平板法,1.75,少,(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为_，突变基因表达的蛋白质含_个氨基酸。解析(1)筛选产脲酶细菌的选择培养基应以尿素为唯一氮源；鉴别培养基还需要添加酚红作指示剂，产脲酶细菌产生的脲酶可以将尿素分解成氨，导致培养基的pH升高，菌落周围的指示剂将变成红色。,UGA,115,(2)图中过程采取的接种方法是稀释涂布平板法，每克土壤样品中的细菌数量为：(156178191)/30.11051.75108，血细胞计数板计数法所得数据包括死的细菌，且稀释涂布平板法计数时所计菌落数少于真正的活细菌数，故与血细胞计数板计数法相比，此计数法测得的细菌数较少。(3)图乙从起始密码算起的碱基序列号为271，前270个碱基决定90个氨基酸，从271位到箭头处可以决定1个氨基酸，然后插入70个核苷酸，可决定23个氨基酸，多出一个碱基，加上后面的AG刚好可以决定1个氨基酸，则后面UGA是终止密码。因此突变基因转录的mRNA终止密码为UGA，突变基因表达的蛋白质所含氨基酸数为901231115(个)。,回答下列问题：(1)该培养基中微生物所需的氮来源于_。若要完成步骤，该培养基中的成分X通常是_。(2)步骤中，实验组的操作是_。(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_现象。若将30(即366)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_(填“正确”或“不正确”)。,牛肉膏、蛋白胨,琼脂,将实验组平板分别放置在教室不同高度的,位置上，开盖暴露一段时间,污染,不正确,解析(1)牛肉膏、蛋白胨都含有N，可为微生物的生长提供氮源。制作无菌平板所用培养基为固体培养基，因此X应为琼脂。(2)由实验目的可知，该实验的自变量为教室的不同高度，因变量为微生物的分布情况，故实验组的操作应为将实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间。(3)空白培养基上出现菌落，说明培养基被污染了，即调查中出现了污染现象。实验过程中若培养基被污染，必须将其抛弃，重新制作新的培养基进行实验。,4(2015全国卷)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用_染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用_(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以_为碳源的固体培养基进行培养。,苏丹(或苏丹),萃取法,油脂,(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用_直接计数；若要测定其活菌数量，可选用_法进行计数。(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35、40、45温度下降解10g油脂所需酶量依次为4mg、1mg、6mg，则上述三个温度中，_条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕_设计后续实验。,血细胞计数板,稀释涂布平板,45,40,解析(1)油脂可被苏丹染液或者苏丹染液染成橘黄色或红色。由于不易挥发，故采用萃取法。(2)产生脂肪酶的微生物B可以分解脂肪，故可以以脂肪为碳源的固体培养基进行培养，不产生脂肪酶的微生物无法生存。(3)微生物B的菌体数，可在显微镜下用血细胞计数板直接计数，测定活菌用稀释涂布平板法。(4)45降解10g油脂所需酶量最大，故酶活性最小；40下降解10g油脂所需酶量最小，故酶活性最大，所以要测定该酶的最适温度，应围绕该温度设计不同温度梯度进行后续实验。,
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