细菌和噬菌体的遗传分析.ppt

1,第六章 细菌和噬菌体的遗传分析,2,第一节 细菌的遗传分析,一、细菌的生物学特征 细菌是单细胞生物，完成每个世代只需20分钟，而且容易得到它的生化突变型，它不仅在医学上和农业上重要，而且从进化角度上也是异常成功的，因为它占据地球上大部分的生物干重。 研究细菌遗传的方法：主要是对细菌菌落形态的遗传研究 (如图，霉菌菌落) 原则上说，培养皿中每个细菌长成的菌落应具有共同的遗传组成，但是由于偶然发生的突变：形态性状的突变，生理特性的突变或抗性的突变，而使这些突变后的细菌所形成的菌落与其他的菌落有所不同。 菌落形态性状的突变包括：菌落的形状、颜色和大小等。,3,霉菌菌落,4,大肠杆菌,5,二、细菌的突变型 （一）营养缺陷型 生理特性的突变包括：丧失合成某种营养物质能力的营养缺陷型。 （二）抗药突变型 抗性突变包括：抗药性或抗感染性。,6,三、细菌有性杂交 1964年Ledeberg和Tatum用大肠杆菌K，证明细菌有性杂交存在。 （一）大肠杆菌杂交试验 A bio-(生物素) met-（甲硫氨酸） thr+（苏） leu+（亮） thi+（VB1） B bio+(生物素) met+（甲硫氨酸） thr-（苏） leu-（亮） thi-（VB1） A、B都为营养缺陷型，在基本培养基上不能生长。,A 、B混合培养，基本培养基上有10-710-8菌落，,7,1、个别细菌由营养缺陷型转变为原养型 a、基因突变 A bio- met- bio+ met+ 或 B thr- leu- thi- thr+ leu+ thi+ 但单独培养都未突变，间接说明不是。 b 、A B二细菌杂交 得 bio- met- thr+） leu+ thi+ bio+ met+ thr+ leu+ thi+ bio+ met+ thr- leu- thi- 2、营养物质互补 A 能合成B不能合成物质,而B能合成A不能合成物质，混合后二种物质被同一细菌利用，可生长。,8,（二）U实验 1950年Davis（戴维斯），做了U实验，在U底部中间用滤片隔开，交替吸压,证明菌落是由于AB二细胞接触杂交基因重组,9,（三）电境观察-接合管,证实有性杂交存在。 问题：AB二细胞遗传物质是混合，还是单向转移。,（四）遗传物质单向转移 Lederberg和Tatum认为细菌杂交似高等生物，二细胞融合基因重 组，1953年Hayes(海斯)在验证杂交时偶尔发现杂交中AB细菌作用不同，遗传物质是单向转移，AB，不能BA。,10,结果不同，表明A、B有性杂交作用不同，提出遗传物质单向转移。 供体：提供遗传物质的细菌 雄性 A 受体：接受遗传物质的细菌 雌性 B 所以 AB 不久发现导致单向转移的是细胞质中一个微小可转移因子F因子,11,四、大肠杆菌 F- F+ Hfr F/菌株 （一）F- F+ 菌株 1、F因子结构: 细胞质中环状DNA，分三个区段 原点：转录起点 致育基 致育基因：决定细菌的育性, 含有育性区的大肠杆菌在细胞 表面有很多毛状的性纤毛（或性伞毛）。 配对区：与细菌环状染色体配对区段相对应，通过简单的单交换可到细菌染色体上。 2、F因子存在方式 游离状态：在细胞质中 ，能自我复制独立遗传 整合状态：整合到细菌环状染色体上，与细菌染色体一起遗传。,12,13,3、F因子的特性 （1）决定大肠杆菌育性 F+菌株，含游离F因子 供体 雄性 F菌株，无游离F因子 受体 雌性 （2）F因子高频率转移 当F+F, F+的F因子复制为二,通过接合管将F因子传递给F菌株,使F转变为F+,频率高达95%,即高频率的转移F因子. 接合管的形成：菌株靠近细胞膜融合两细胞间形成接合管 F因子转移：F因子从原点断裂，以原点为先导，边复制边转移（因此叫滚环复制），复制后的F因子转移到另一个细胞中。细胞分开，使F-变成F+。 (3)基因重组的频率低 当F+F, F+菌株环状DNA复制通过接合管进入F-细菌细胞，与F-细菌的基因交换，使基因重组，但频率很低1%，菌落很少。 (4)F因子可以自发丧失,14,（二）高频重组菌株 （Hfr菌株） 1951年，卡瓦里（Cavalli）等人，1954年海斯（Hayes）先后在A菌株中分离出新的菌株。 1.1.特点 (1 1)可以作为供体，与B杂交，重组频率比AB高1000倍，称高频重组菌株。 ( 2)转移F因子频率低 2、2.Hfr形成 F因子整合到细菌环状DNA上，这种整合状态F菌株叫Hfr（高频重组）。,15,3、HfrF-,杂交过程也是先形成接合管，然后Hfr边复制边转移，转移的顺序：原点配对区大肠杆菌基因配对区育性基因。 整合到细菌环状染色体上的F因子容易在原点处断开，并以线性以原点为起点进入受体细胞中，将细菌环状染色体上基因带入受体细胞中，基因重组频率高。但在转移过程中，结合管很易断开，这样转移到受体的部分只是靠近原点的一部分（全部转移需温和条件120分钟），形成部分二倍体。致育基因位于最后，而接合管随时可能断开，转移F因子频率低。,16,(三)接合生殖和交换特点 1、接合生殖 供体细菌的DNA通过接合管进入受体细菌，实现基因重组的方式。 由于Hfr或F的DNA在转移过程中，结合管很易断开，进入受体细胞的DNA仅部分，在受体细胞中染色体为部分二倍体。 2、基因重组 （1）部分二倍体：一个完整的基因组和一个不完整的基因组所构成的二倍体。其中受体的基因组叫内基因子，供体的基因组叫外基因子。 外基因子转移到受体以后，a) 以游离状态存在，随着细胞分裂代数的增加被稀释，消失；b）与内基因子发生交换、重组。 (2)基因交换过程：,17,18,（3）交换特点 交换发生在完整的F环状染色体和供体线性染色体片段之间即部分二倍体 奇数交换，形成一个线状分子，在大肠杆菌中不能复制，导致细胞死亡；无效交换。偶数交换，形成环状重组体（有效）和线状分子（不能复制，消失）。 只出现一种重组子（杂交后代），无对应重组体，真核生物出现四种杂交后代。 (四) F/菌株 F因子可从Hfr脱离成为F+，通常准确脱离，偶尔不准，使F因子带有细菌的个别基因。这种带有细菌个别基因的F因子，称F/菌株。 （五）大肠杆菌的F-、F+、Hfr、F、菌株,19,五、细菌的遗传作图 （一）细菌的遗传重组 原核生物的遗传重组实质上是指受体中插入来自供体的遗传性不同的DNA片段，并把这种DNA片段或它的复本整合为受体基因组的一部分。受体的遗传重组可以通过三种途径来实现： 1、接合 供体细菌的DNA通过接合管进入受体细菌，实现基因重组。 2、转化 游离的细菌DNA片段被不同的细菌细胞（受体）吸收. 3、转导 一种细菌的DNA片段经过温和的或有缺陷的噬菌体传递给另一种细菌,20,（二）利用中断杂交试验作图 人为的中断大肠杆菌杂交而进行的基因定位叫中断杂交法。 1、原理： 2、方法 沃尔曼（Wollman）、雅各布（Jacob） 叠氮化钠 噬菌体 乳糖 半乳糖 链霉素 Hfr azir tonr lac+ gal+ strs F-： azis tons lac- gal- strr 将 Hfr与F-同时加入装有完全培养基的大试管中，一定时间取样振荡，稀释接种至添加str的基本培养基（葡萄糖和无机盐）上，生长形成的菌落基因型为F-strr(F-或具Hfr部分基因的F-)，再把菌落分别转移到只添加azi、ton、以lac或gal为炭源的选择性培养基上。,21,进入F-的Hfr基因 8/ 不生长 有噬菌斑 不生长 不生长 无 9/ 生长 有噬菌斑 不生长 不生长 azir 11/ 生长 无噬菌斑 不生长 不生长 azir tonr 18/ 生长 无噬菌斑 生长 不生长 azir tonr lac+ 24/ 生长 无噬菌斑 生长 生长 azir tonr lac+ gal+ F因子约在120分钟后进入。,22,（1）Hfr的基因按一定顺序和时间间隔进入F- （2）每个基因进入F-有一定频率，且在短时间内达到最高 （3）进入F-越早，频率越高 （4）F因子进入迟，频率低,3、Hfr染色体上基因排列顺序,23,4、细菌染色体为环状,24,(三) 基因重组作图 利用交换值做出连锁基因图 例如：已知lac+ 和ade+紧密连锁，由中断杂交知lac+ 比ade早进入受体。 作出两连锁基因连锁图。 选用杂交亲本为Hfr lac+ ade+ strsF- lac- ade-strR混合后接种,由于lac+ 比ade+先进入受体，此时lac+ 已进入受体但不一定重组到细菌染色体上，两种情况：,25,(四) 重组作图,如果两个基因间的转移时间小于2分钟，用中断杂交法所得的图距不太可靠，应采用传统的重组作图法。例如，有两个紧密连锁的基因lac-(乳糖不发酵)和ade-(腺嘌呤缺陷型)，为了求得两个基因间的距离，可采用Hfr lac+ ade+和F- lac- ade-的杂交实验。用完全培养基但不加腺嘌呤，可以选出F- ade+的菌落。,26,检测：,27,lac- ade+菌落数上菌落数上菌落数 交换值lac- ade+菌落数/ ade+菌落数 或将影印到EMB（伊红甲基蓝）完全培养基上 lac+ade+ 能发酵乳糖 菌落紫红色 lac- ade+ 不能发酵乳糖 菌落白色 由上求出交换值为22，由中断杂交实验得到lac+比ade+早1分钟进入受体，大量实验统计1分钟20。,28,重组作图,29,一 噬菌体结构和类型 （一）结构 病毒是比细菌更为简单的生物，它们也只有一条染色体，即单倍体。有些病毒的染色体是DNA，还有一些病毒是RNA。 病毒主要是由蛋白质外壳及其包被的核酸所组成的颗粒。病毒可根据宿主(动物、植物、细菌)或遗传物质(DNA或RNA)来分类。细菌病毒(Bacterial phage)，称为噬菌体(phage)(如图)，是目前经过广泛研究，了解比较清楚的一种病毒噬菌体是指浸染细菌、放线菌以及真菌的病毒。都没有细胞结构，由一个蛋白质外壳包围一段DNA或RNA（烟草花叶病毒为RNA病毒）。,第二节 噬菌体的遗传分析,30,噬菌体,31,(二)类型 烈性噬菌体 遗传学上应用较广泛的是大肠杆菌的T偶数系列噬菌体。它们的外貌都象蝌蚪状(如图)。 T偶数系列噬菌体具有六角形的头部，其内部含有双链DNA分子，尾部包括一个中空的针状结构及外鞘。末端是基板，由尾丝及尾针组成。 T偶数系列噬菌体的尾丝附着在大肠杆菌表面时，通过尾鞘的收缩将噬菌体DNA经中空尾部注入寄主细胞，破坏寄主细胞的遗传物质，并合成大量的噬菌体DNA和蛋白质，组成许多新的子噬菌体，最后使细菌裂解，释放出无数个子噬菌体。所以这样的T偶数系列噬菌体称为烈性噬菌体。,32,33,温和噬菌体 温和噬菌体侵入细菌后，细菌并不裂解，即它们有溶源性的生活周期。例如和P1噬菌体可代表略有不同的溶原性类型。 噬菌体附着在大肠杆菌染色体的gal和bio位点之间的att座位上，它能通过交换而整合到细菌染色体上，整合的噬菌体称为原噬菌体(图)。,34,35,原噬菌体,36,P1噬菌体不整合到细菌的染色体上，而是独立地存在大肠杆菌的细胞内。 原噬菌体通过紫外线照射，或温度改变可转变为烈性噬菌体。,P1噬菌体,37,二、噬菌体的突变型 快速溶菌突变型 少量T系列噬菌体（如T2）和大量大肠杆菌混合，涂于固体平板，噬菌体裂解速度越快，出现的噬菌斑越大。 野生型r+ 噬菌斑小，边缘模糊 快速生长突变型r 噬菌斑大，边缘整齐 基因型 r+ r- 表现型 噬菌斑小 噬菌斑大 溶菌时间 30 20 ,寄主范围突变型 野生型T2（用h+表示）：只能浸染B菌株（对T2敏感的细菌），不能感染B2菌株（抗T2的细菌）； T2突变型（用h表示）：既能浸染B菌株，也能浸染B2菌株。当在含有B/B2的固 体培养基上接种h+后，出现半透明的噬菌斑；而接种h后，出现透明的噬菌斑。,38,三、 噬菌体的基因重组和遗传作图 h+r hr+ 子代噬菌体基因型 h+r hr+ h+r+ hr 含B/B2培养基上噬菌斑 大半透明 小透明 小半透明 大透明 交换值重组型噬菌体数/总噬菌斑数100%= h+r+hr/总100% =小半透明+大透明/总100% （二）连锁图 T2快速溶菌突变型有多种，如ra、rb、rc都形成大噬菌斑，用不同类型快速溶菌突变型与宿主范围突变型杂交，结果如下： 杂交组合 h+r hr+ h+r+ hr 重组值 hr图距 h+rahr+ 34.0% 42% 12% 12% 24% 24 h+rbhr+ 32.0% 56% 5.9% 6.4% 12.3% 12.3 h+rchr+ 39.0% 59% 0.7% 0.9% 1.6% 1.6 按图距h、ra、rb、rc有4种排列,39,求drb-rc B型快速溶菌 rbrc+C型快速溶菌 rb+rc 混合感染大肠杆菌B， 子代噬菌体 rbrc+ rb+rc rb+rc+ rbrc 噬菌斑 大 大 小 大 交换值 rb+rc+ rbrc/总100%2小噬菌斑/总100% 求出drb-rcdrb-h， rb rc在同侧 实验表明（1）（2）都成立，提出连锁图为环状,如（1）（2）rb、rc同侧，则drb-rcdrb-h 如（3）（4）rb、rc两侧，则drb-rcdrb-h,40,T系列偶数噬菌体DNA为线状，但基因连锁图表型环状。因T系列偶数噬菌体DNA末端重复头尾端具有相同基因序列，进入宿主复制，重复分末端可能配对而端端相连成环状。,41,四、转导 转导是指以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质的重组过程（一）普遍性转导（由烈性噬菌体介导） 没有特异性的转导叫普遍性转导 （二）局限性转导 （三）转导的特点 （1）转导是以噬菌体为介导的； （2）重组发生在部分二倍体中； （3）只出现一种重组子，不出现相反的重组子（如gal-消失，只剩下gal+）。,42,